清热凉血解毒方对大鼠痔术后创面愈合及炎症因子表达的影响∗

刘 超 王振彪 王 垚 彭俊付 王 锐

（1.首都医科大学附属北京世纪坛医院，北京100038；2.首都医科大学附属北京怀柔医院，北京 101400；3.北京中医药大学东直门医院，北京 100700）

痔是肛肠外科常见多发疾病，主要以手术治疗为主，术后创面修复机制复杂，手术创伤其邻近组织的牵拉挤压等导致肛门水肿、疼痛、创面感染等，严重影响患者的预后和生活质量。如何减少痔术后创面疼痛，加速创面愈合为临床亟待解决的问题[1-3]。现代研究发现炎症因子和炎症细胞对炎症过程具有决定作用，血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）和白介素-8（IL-8）等与脂多糖协同，刺激、激活更多炎症介质的表达，从而放大和加重炎症反应[4-5]。炎症因子能对痔血管壁及血管内皮能造成氧化损伤，被氧化损伤的血管壁又不断产生炎症因子。血管内皮生长因子（VEGF）可增加血管的通透性，减轻受损的血管内皮细胞引起的功能障碍，加速受损的血管内皮细胞愈合，促进新生血管愈合。前列腺素E2（PGE2）是疼痛和炎症的重要因子，在体内发挥着重要的调节功能，参与炎症反应各阶段[6-7]。

中医认为，痔疮病因主要为先天不足，脏腑本虚，饮食不节，过食辛辣之物等导致血管弛缓、经脉瘀滞，痔术后创面多为湿邪所困，气血运行不畅，虚实夹杂，使得创面愈合更加缓慢，治宜清利湿热，祛瘀活血止痛，消水肿促生肌[8-9]。清热凉血解毒方为北京世纪坛医院肛肠科经验方，对痔术后创面具有较好的治疗作用，但其作用机制尚不明确。因此，本研究通过干预大鼠痔术后创面感染模型，旨在探讨清热凉血解毒方对大鼠痔术后创面愈合的作用及对相关炎症因子表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级SD大鼠，雌雄各半，8周龄，体质量（200±20）g，购于浙江省实验动物中心，许可证号：SCXK（浙）2014-0001。动物室温饲养，自然采光，自由饮水，适应性饲养7 d后进行实验研究。

1.2 试药与仪器 清热凉血解毒方，组成：黄连12 g，黄柏20 g，栀子10 g，生大黄15 g，苦参15 g，地榆10 g，白芍 20 g，秦皮 15 g，白头翁 10 g，延胡索 20 g，茵陈10 g，紫草10 g。上述中药饮片由北京世纪坛医院中药房提供，药材加水煎煮2次，分别浓缩至1 mL含0.5、1、1.5 g原药材的药液，作为清热凉血解毒方低、中、高剂量。冰醋酸、水合氯醛，购于国药集团化学试剂有限公司；HE染色试剂盒购于武汉阿斯本生物技术有限公司（批号分别为：AS1055A、AS1055B），TNF-α、IL-6和IL-8试剂盒购于碧云天生物科技有限公司（批号分别为：J190064、J190127和J190376），PGE2和VEGF单抗购于武汉阿斯本生物技术有限公司（批号分别为bs-7402R和bs-0167R）；二抗（河北博海生物工程开发有限公司，批号：20190424）。手术器械，苏州六六视觉医疗设备公司生产；BX60显微镜，日本Olympus Optical公司生产；切片机，德国莱卡公司；ELx800酶标仪，美国伯腾仪器有限公司。

1.3 模型制备 将50只雄性SD大鼠分为空白对照组、模型组及清热凉血解毒方低、中、高剂量组，每组10只。除空白对照组外，其余大鼠采用肛周局部注射冰醋酸法建立痔术后创面感染模型[10]。碘伏棉球消毒大鼠肛周皮肤，75%冰醋酸扇形注射于大鼠肛门外周皮下，注射后局部按摩肛周，使药液充分弥散。注射后24 h观察肛门局部溃疡、红肿、炎性渗出等。造模成功标准为肛门局部红肿隆起≥1mm，超过溃疡面，炎症渗出多，溃疡面＞0.3 cm2。

1.4 给药方法 于造模成功后第2天进行药物治疗。空白对照组和模型组给予生理盐水灌胃，清热凉血解毒方低、中、高剂量组分给予0.5、1、1.5 g/mL的清热凉血解毒方灌胃，剂量均为10 mL/kg，每日1次，连续给药7 d。

1.5 标本采集与检测 1）肛周水肿程度和创面面积检测。末次给药后，测量肛周创面的溃疡面积大小及水肿的程度，并进行标准评分。无水肿为0分，勉强可见为1分，边缘高于皮肤为2分，明显肿胀为3分。2）炎症因子检测。10%水合氯醛1 mL/100 g麻醉处死各组大鼠前，眼球取血，离心，取上清，采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定血清TNF-α、IL-6和IL-8水平，严格按照说明书操作。3）肛周组织HE染色。于末次给药24 h后，10%水合氯醛1 mL/100 g水合氯醛麻醉处死各组大鼠，取肛周组织，生理盐水清洗后，固定48 h后，二甲苯脱脂，酒精脱水，石蜡包埋，切片，乙醇水化，苏木精染色，1%盐酸乙醇溶液分化，自来水冲洗返蓝，浸入伊红染液，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶进行封片，显微镜下观察。4）免疫组化检测VEGF和PGE2。取上述病理切片，充分脱蜡，1%甲醇双氧水处理、抗原修复液修复、封闭、添加VEGF和PGE2一抗，二抗；链霉卵白素工作液处理，DAB显色，苏木素复染，封片，光学显微镜下选5个视野观察。阳性表达为棕黄色，蛋白表达量积分光密度（IOD）表示。

1.6 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件。计量资料以（）表示，采用t检验比较组内和组间差异；计数资料以百分率（%）表示，应用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠肛周水肿程度评分和创面面积比较见表1。与空白对照组比较，模型组肛周水肿程度评分和创面面积显著高于空白对照组，清热凉血解毒方各剂量组水肿程度评分和创面面积显著低于模型组，且中、高剂量组低于低剂量组（P＜0.05），但清热凉血解毒方中剂量组和高剂量组比较无显著差异（P＞0.05）。

表1 各组大鼠肛周水肿程度评分和创面面积比较（±s）

表1 各组大鼠肛周水肿程度评分和创面面积比较（±s）

与空白对照组比较，∗P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与清热凉血解毒方低剂量组比较，△P＜0.05。下同

组别空白对照组模型组清热凉血解毒方低剂量组清热凉血解毒方中剂量组清热凉血解毒方高剂量组n 10 10 10 10 10水肿程度评分（分）0.15±0.03 2.31±0.37*1.86±0.34*#1.02±0.27*#△0.93±0.31*#△创面面积（cm2）0.11±0.02 3.12±0.43*2.11±0.38*#1.32±0.29*#△1.17±0.33*#△

2.2 各组大鼠肛周组织HE染色比较 见图1。空白对照组肛周组织正常，细胞排列有序，细胞轮廓清晰、结构完整，无水。与空白对照组比较，模型组肛周组织间隙疏松水肿，鳞状上皮大片状坏死，固有层大量淤血，可见大量中性粒细胞浸润，黏膜下层局部纤维断裂，小静脉扩张，有毛细血管增生。清热凉血解毒方各剂量组间隙疏松水肿不明显，少量鳞状上皮坏死，少量中性粒细胞，毛细血管增生不明显。

图1 各组大鼠肛周组织病理学观察（HE染色，400倍）

2.3 各组大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-8水平比较见表2。与空白对照组比较，模型组外周血TNF-α、IL-6和IL-8水平显著升高，清热凉血解毒方低、中、高剂量组外周血各指标显著低于模型组，且清热凉血解毒方中、高剂量组显著低于清热凉血解毒方低剂量组（P＜0.05）。但清热凉血解毒方中剂量组和高剂量组比较无显著差异（P＞0.05）。

表2 各组大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-8水平比较（±s）

表2 各组大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-8水平比较（±s）

组别空白对照组模型组清热凉血解毒方低剂量组清热凉血解毒方中剂量组清热凉血解毒方高剂量组n 10 10 10 10 10 TNF-α（ng/mL）28.17±3.91 211.41±14.62*153.47±12.67*#101.19±10.39*#△95.76±11.1*#△IL-6（pg/mL）13.65±1.86 99.65±10.07*72.34±8.12*#50.37±6.54*#△57.59±7.26*#△IL-8（pg/mL）11.47±2.12 123.51±9.67*80.62±8.35*#58.14±7.75*#△55.63±8.03*#△

2.4 各组大鼠肛周VEGF和PGE2蛋白水平比较 见表3，图2。与空白对照组比较，模型组VEGF和PGE2水平显著升高，清热凉血解毒方各剂量组VEGF和PGE2水平显著低于模型组，且清热凉血解毒方中、高剂量组VEGF和PGE2显著低于清热凉血解毒方低剂量组（P＜0.05）。但清热凉血解毒方中剂量组和高剂量组比较无明显差异（P＞0.05）。

表3 各组大鼠肛周VEGF和PGE2蛋白水平比较（IOD，±s）

表3 各组大鼠肛周VEGF和PGE2蛋白水平比较（IOD，±s）

组别空白对照组模型组清热凉血解毒方低剂量组清热凉血解毒方中剂量组清热凉血解毒方高剂量组n 10 10 10 10 10 VEGF 0.25±0.04 1.73±0.14*1.01±0.12*#0.68±0.11*#△0.65±0.13*#△PGE2 0.31±0.07 1.96±0.16*1.12±0.13*#0.81±0.12*#△0.79±0.11*#△

图2 各组大鼠肛周VEGF、PGE2蛋白免疫组化表达（DAB，40倍）

3 讨 论

痔的发病主要有直肠海绵体学说、肛垫移位学说、窦状静脉扩张学说等，与饮食、生活、孕产、工作、年龄等因素密切相关[11-12]。痔易反复发作，药物治疗效果欠佳，严重影响生活质量，手术治疗为最终选择，但因肛周内外括约肌分布着丰富的神经，痛觉非常敏感，手术创伤、术后排便用力等会刺激肛门神经感受器，导致括约肌痉挛、收缩，局部循环障碍，肛缘血管渗透压增加，引起肛门疼痛水肿，术后创面难以愈合[13]。痔术后局部组织损伤，升高的巨噬细胞参与炎症反应，引起白细胞、淋巴细胞及TNF-α、IL-6和IL-8水平升高，激活更多炎症介质的表达，加重症反应，导致术后创面难以愈合[14]。术后创面愈合须经过创面渗出期、肉芽生长期和上皮细胞生长期，炎性渗出阶段产生各种机体修复因子，加速肉芽生长。最强促血管生长因子VEGF，可通过内皮细胞有丝分裂原调控内皮细胞增殖，使肉芽组织加速生长，改善局部血流量，促进细胞增生和血管再生[15]。PGE2主要参与发热、炎症反应、疼痛感知等生理及病理生理过程，在炎症反应各阶段进行炎症调控，对痔大鼠模型肛周溃疡炎症有明显的抑制作用[16]。因此，本研究从VEGF和PGE2水平变化探讨清热凉血解毒方对大鼠痔术后创面愈合的作用机制。

痔病是中医学中最早记载的疾病之一。湿热蕴结，脏腑本虚，加之外感六淫、七情内伤等引起的脏腑失调是导致痔病的主要原因。患者局部受损，气血阻滞，经络不畅，感染邪毒，加之湿邪困阻，气血瘀滞更甚，导致术后创面愈合缓慢[17]。中医药既可以促进创伤后组织修复，减轻组织炎症反应，又可以减少毛细血管的通透性，从多环节、多靶点来发挥作用[18]。清热凉血解毒方中黄连、黄柏、栀子清热燥湿、泻火解毒；生大黄泻下攻积、清热泻火、凉血解毒；苦参清热燥湿、祛风杀虫、泻火解毒；地榆清热燥湿、泻火解毒、凉血止血、逐瘀敛疮；白芍行气止痛消肿；秦皮清热燥湿、收涩止痢；白头翁清热解毒、凉血止痢；延胡索活血散瘀、理气止痛；茵陈清热利湿；紫草清热解毒，凉血消肿。全方诸药配合，共奏清热凉血、燥湿解毒功效。清热凉血解毒方对痔术后创面具有较好的治疗作用，但其作用机制尚不明确。

本研究发现，清热凉血解毒方各剂量组水肿程度评分和创面面积显著低于模型组，说明本方可改善肛周组织病理结构。清热凉血解毒方各剂量组TNF-α、IL-6、IL-8水平和VEGF、PGE2水平显著低于模型组，且清热凉血解毒方中、高剂量组明显优于低剂量组。这些效果可能与以下作用有关：方中黄连抑制体内多种细菌，抵抗体内内毒素释放；黄柏有抗真菌和病毒的作用，还可抑制中枢神经系统和细胞免疫反应；栀子内环烯醚萜类化合物可抗炎、抗氧化、利尿、解热、镇痛等，大黄酸、大黄素等通过游离蒽醌及其苷类调节TNF-α、血清淀粉酶等达到抗炎、抗菌抗病毒作用；苦参碱、槐果碱等发挥抗炎、抗病原微生物、降低毛细血管通透性等作用，并可促进血管新生，改善创面微循环；地榆有抗菌、免疫调节、抗炎消肿、修护受损皮肤等作用[19-22]。

综上所述，清热凉血解毒方可有效促进大鼠痔术后创面愈合，改善肛周组织，降低炎症反应，其机制可能与降低VEGF和PGE2水平有关。