芒果、胡萝卜复合果酒发酵过程中理化成分和香气物质的变化

孟金明,樊爱萍,和川琦,曾丽萍

(红河学院理学院,云南蒙自 661100)

芒果是一种非常受欢迎的热带水果,果实含水量在80%左右,含糖量在12%左右,具有肉质丰厚、汁多味甜及香气浓郁等特点,同时富含人体所需的糖类、蛋白质、维生素和矿物质,其中胡萝卜素含量较高[1-2]。但是,芒果水分含量高,果皮比较薄,在采摘、运输过程中极易造成损伤和腐烂,造成资源浪费,因此芒果的深加工工艺亟需要得到发展[3]。胡萝卜又称红萝卜或甘荀,其含水量在80%以上,含糖量在10%左右,且富含蛋白质、膳食纤维素、β-胡萝卜素和多种维生素,又含有丰富的钙、铁等矿物质,营养价值较高。胡萝卜还具有预防夜盲症、干眼病,降低血糖、血脂,增强人体免疫力等功效[4],因此芒果和胡萝卜都是适合酿造果酒的原材料。

果酒不仅保留了果汁中的大量功能性物质,如:多糖、多酚、黄酮、维生素、氨基酸以及多种矿物质,赋予果酒较高的营养价值。而且,在果酒的酿造过程中酵母会利用果汁中的糖类物质,生成醇类、酯类、酸类、酚类等物质,这些物质相互作用,赋予果酒独特的口感和风味[5]。目前对于果酒的理化参数和香气物质的研究主要集中在单一果酒,其中,饶炎炎等[6]对红树莓果酒发酵过程中功效成分、香气物质及体外降血糖功效的动态变化进行研究得出,在红树莓果酒发酵过程中酒精度先上升后趋于平稳,活性成分呈先上升后下降趋势,在发酵过程中酮类物质不断减少,醇类和酯类物质有所增加,红树莓果酒中主要香气物质为酯类;杨芳等[7]对发酵型桑葚果酒酿造过程中总糖、总酸、总黄酮、乙醇的变化规律以及桑葚果酒香气成分进行研究得出,在桑葚果酒酿造过程中总糖先下降后趋于稳定,总酸、总黄酮、乙醇先上升后趋于稳定;相比于发酵18 d的桑葚果酒香气物质,发酵24 d的酯类物质和醇类物质相对含量降低,酸类物质则升高。但目前对于芒果胡萝卜复合果酒发酵过程中理化和风味变化的研究鲜有报道。

在生产过程中,对芒果胡萝卜复合果酒发酵过程的理化指标进行实时监测,便能掌握果酒的发酵进程,实现对发酵条件进行针对性的控制,从而得到高品质的复合果酒。通过对复合果酒发酵过程香气物质变化的分析,可以探究复合果酒风味物质形成的机理,为复合果酒的品评以及评定提供依据。因此,本研究拟通过对芒果胡萝卜复合果酒发酵过程中主要理化成分和香气物质变化进行分析,初步揭示芒果胡萝卜复合果酒发酵过程中主要物质的变化规律,以期为芒果胡萝卜复合果酒发酵过程的控制提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

芒果、胡萝卜 市售;纤维素酶、果胶酶、焦亚硫酸钾、柠檬酸 友谊食品添加剂公司;安琪果酒酵母 安琪酵母有限公司;没食子酸标准品、甲醇标准品(色谱纯,纯度≥98%) 购自 Aladdin 公司;其余化学药品 均为国产分析纯(AR);实验室用水 均使用蒸馏水。

GCMS-QP2010气相色谱-质谱联用仪 日本岛津有限责任公司;GC-2010气相色谱仪 日本岛津有限责任公司;T6紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司 GSP-9160 MBE隔水式恒温培养箱 上海博讯实业有限公司;CP224C电子天平 上海奥豪斯仪器有限公司;DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱 上海齐欣科学仪器有限公司;HWS26型电热恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司;YL-Y15型九阳高速破壁调理机 九阳股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 芒果胡萝卜复合果酒的发酵工艺流程 芒果原料挑选→清洗→去皮、去核→切分→破碎→打浆;

胡萝卜原料挑选→清洗→去皮、切块→热烫→破碎→打浆;

1.2.2 操作要点 预处理:挑选新鲜、无虫害、无机械损伤的八成熟芒果,清洗干净,去除果皮和果核,将果肉切分成1 cm×1 cm×1 cm的小方块,按1∶1 (m/m)的比例加蒸馏水,破碎打浆。挑选成熟度一致的胡萝卜,洗净去皮,切成1 cm×1 cm×1 cm的小方块,95 ℃热烫6 min,将处理后的水果与蒸馏水按1∶2 (m/m)的比例混合,破碎打浆。

酶解:将芒果浆和胡萝卜浆按2∶1 (v/v)比例混合,按0.1 g/L的用量分别加入纤维素酶和果胶酶,50 ℃恒温水浴搅拌3 h,酶解后迅速加热至90 ℃灭酶5 min。

调配:添加适量偏重亚硫酸钾,初始二氧化硫浓度在55 mg/L,用白砂糖调节将果汁含糖量调至24%,用柠檬酸调果汁的pH至3.4。

酵母活化:称取2 g的活性干酵母加入到30 mL 3%的葡萄糖水溶液中,37 ℃活化0.5 h。

主发酵:将活化后的酵母按0.12%的量接种,接种完之后,放入到恒温培养箱中,26 ℃发酵8 d。

澄清:将壳聚糖与皂土按2∶1 (m/m)的比例复合制成复合澄清剂,澄清剂添加量为2 g/L,于45 ℃水浴处理40 min,置于室温静置48 h之后过滤得到澄清酒液。

1.2.3 酒精度、残余总糖、总酸、挥发酸、干浸出物的测定 酒精度测定:采用密度瓶法[8];总糖测定:采用直接滴定法[8];总酸和挥发酸测定:采用指示剂法[8];干浸出物测定:采用密度法[9]。

1.2.4 总酚的测定 总酚(以没食子酸计)含量的测定采用福林-酚(Folin-Ciocalteu)法[10]标准曲线制作:称取10 mg没食子酸,定容至100 mL。分别吸取上述没食子酸对照品溶液 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL于25 mL棕色容量瓶,后加入1 mL Folin-Ciocalteu 试剂、3 mL 20%的Na2CO3溶液,混匀并定容至刻度,室温下避光放置1 h,于760 nm波长处测定吸光度,以没食子酸浓度为横轴,吸光度值为纵轴,绘制标准曲线,方程为y=0.0906x-0.0102,R2=0.9975。样品测定时取 1 mL样品参与上述反应,于760 nm波长处测定其吸光度值,根据标准曲线计算芒果胡萝卜发酵液总酚的含量。

1.2.5 甲醇的测定

1.2.5.1 甲醇标准溶液配制 将甲醇标准物质用乙醇配制成5000 mg/L的甲醇标准储备液,再将其逐级稀释成浓度分别为50、100、200、300、400 mg/L的甲醇标准工作溶液。

1.2.5.2 样品的制备 用100 mL容量瓶准确量取100 mL酒样加100 mL水于500 mL蒸馏瓶中,加热蒸馏出100 mL蒸馏液。

1.2.5.3 色谱条件 RX-17(30 m×0. 25 mm,0. 25 μm);程序升温模式为起始温度40 ℃,保持4 min,以4.5 ℃/min升温至120 ℃,保持3 min,再以20 ℃/min升温至200 ℃,保持5 min。检测器温度为 250 ℃;进样口温度为250 ℃;载气(N2)流速1.0 mL/min;进样量1.0 μL;分流比为20∶1[11]。

1.2.6 果酒香气成分GC-MS分析

1.2.6.1 样品前处理萃取条件 取芒果胡萝卜果酒10 mL置于15 mL装入顶空瓶中,约占顶空瓶的1/2,加入0.15 g NaCl,加盖密封,放入60 ℃水浴中平衡5 min,插入经老化后的萃取头顶空萃取50 min后,再将萃取头插入进样口,于220 ℃解吸5 min,进行GC-MS检测分析。

1.2.6.2 气相色谱条件 色谱柱为DB-Wax;进样口温度为230 ℃;升温程序:初始温度40 ℃保持3 min,以6 ℃/min升至130 ℃保持5 min,以4 ℃/min升至230 ℃保持2 min。载气为氦气,流速1.0 mL/min,分流比5∶1。

1.2.6.3 质谱条件 EI电离源,电子能量为70 eV,灯丝流量为0.20 mA,离子源温度为200 ℃,接口温度为250 ℃,扫描范围30.00～500.00 amu。

1.2.6.4 质谱数据处理 将采集到的质谱图与NIST 08图谱库进行检索对比,确定样品的挥发性成分,并用气相色谱峰面积归一化法定量计算各成分的相对含量[12]。

1.3 数据处理

采用Origin 2017软件进行数据的初步处理及作图,用SPSS Statistics 19.0软件进行显著性分析,认为P<0.05时差异显著,试验结果用均值±标准差(x±n,n=3)表示。

2 结果与分析

2.1 芒果胡萝卜复合果酒发酵过程中总糖与酒精度含量的变化

总糖和酒精度是考察果酒发酵是否正常进行的重要指标,其变化情况如图1所示。从图1可知,在发酵初期,总糖含量急剧下降,在发酵前3 d由241.4 g/L降至77.6 g/L,酒精度迅速升高,从0迅速升至9.43%vol。这是因为在发酵初期发酵液中营养丰富,酵母菌迅速增殖代谢旺盛,消耗大量的糖类用于自身的繁殖以及酒精的合成。在发酵后期总糖下降,酒精增长速率趋于平缓,是因为随着发酵的进行,酵母生长进入稳定期,且随着发酵液酒精浓度的升高酵母菌受到乙醇胁迫,导致代谢减缓,糖分消耗和酒精合成速率降低[13]。在发酵6 d后,酵母进入衰亡期,发酵液总糖含量和酒精度趋于稳定。结果表明,复合果酒发酵过程酒精度的变化与酵母菌的生长密切相关,与总糖含量呈现负相关。

图1 芒果胡萝卜复合果酒发酵中总糖与酒精度含量的变化Fig.1 The changes of total sugar and alcoholduring fermentation of compound fruit wine

2.2 芒果胡萝卜复合果酒发酵过程中总酸与挥发酸含量的变化

总酸不仅能够影响微生物的生长代谢,而且对果酒风味、色泽以及口感的形成具有决定作用。由图2可知,芒果胡萝卜复合果酒发酵初期总酸含量上升明显,在发酵前4 d由5.5 g/L增加到8.4 g/L。随着发酵的进行,酵母代谢的减缓,总酸含量增加缓慢,发酵6 d后总酸基本趋于稳定。在发酵前期发酵液营养丰富,葡萄糖在酵母中除了经过EMP途径产生乙醇外,还会通过HMP途径等其他方式产生乳酸、柠檬酸等一些有机酸[14]。因此,在发酵初期总酸的含量会迅速增加,发酵至第6 d发酵液中的糖分被消耗殆尽,而且较高的酸度在一定程度上抑制了酵母的代谢,造成总酸含量变化趋于稳定[15]。挥发酸是酵母不完全发酵形成的副产物,适量的挥发酸能使果酒香气宜人,但挥发酸含量过高,会带来尖酸感和醋味,将严重影响果酒的口感和品质[16]。由图2知,复合果酒发酵过程中挥发酸含量先上升后略有下降,与总酸含量变化相一致。

图2 芒果胡萝卜复合果酒发酵中总酸和挥发酸含量的变化Fig.2 The changes of total acid and volatileacid during fermentation of compound fruit wine

2.3 芒果胡萝卜复合果酒发酵过程中总酚含量的变化

果酒中的酚类物质不仅可以影响酒体的颜色,还会对果酒的口感、风味以及澄清产生影响。酚类物质还具有抗氧化和增加抵抗力的作用,赋予果酒较高的营养价值[17]。由图3可知,在发酵前3 d发酵液总酚含量迅速升高,由360.6 mg/L增加至395.2 mg/L,随后总酚含量开始不断降低。发酵初期酵母菌将复杂的大分子酚类物质转化为小分子的酚类物质,以及酵母乙醇代谢生成乙醇,果肉中的酚类物质溶于乙醇进而使得发酵初期(1～3 d)果酒总酚含量显著增加。随着发酵时间的延长,酵母菌合成大量次级代谢产物,与多酚物质发生氧化、聚合或沉淀等反应,使得发酵液中总酚含量逐渐减少[18]。

图3 芒果胡萝卜复合果酒发酵中总酚含量的变化Fig.3 The changes of total phenols duringfermentation of compound fruit wine

2.4 芒果胡萝卜复合果酒发酵过程中干浸出物含量的变化

果酒中干浸出物的含量与果酒原料品质、生产工艺及储藏方式等有密切联系,干浸出物的含量决定了果酒的主体骨架,对果酒的口感影响较大,是衡量果酒品质的重要标准之一[19]。由图4知,在发酵前4 d,干浸出物含量迅速上升,由7.5 g/L升高至24.2 g/L。发酵初期发酵液糖类物质丰富,酵母代谢活动旺盛,发酵液中有机酸和酚类物质的增多,酒精度的升高使得果肉中色素溶出等原因使得果酒干浸出物含量不断升高,在发酵后期随着有机酸的减少以及酚类物质的氧化,干浸出物的含量略有下降。

图4 芒果胡萝卜复合果酒发酵中干浸出物的变化Fig.4 The changes of dry extract duringfermentation of compound fruit wine

2.5 芒果胡萝卜复合果酒发酵过程中甲醇含量的变化

甲醇是果酒中常见的一种有害成分,当人体摄入过量的甲醇时,会出现严重的中毒反应,如失明甚至死亡[20]。因此,甲醇是在果酒发酵过程中需要重点控制的参数。由图5可知,芒果胡萝卜复合果酒发酵过程中,在发酵初期(1～3 d)发酵液甲醇含量迅速升高,由17 mg/L增至88 mg/L,升高了4.2倍。由于发酵液中的果胶大量被水解,生成大量甲氧基,其次,酵母菌的甘氨酸代谢途径也会合成甲醇,造成发酵前期甲醇含量剧烈升高[21]。随着发酵的进行,果胶水解速率降低,酵母进入衰亡期,甲醇的生成趋于停止,在发酵6 d时甲醇含量达到最高值103 mg/L,随后甲醇含量略有下降,可能是因为发酵后期甲醇略有挥发散失,也可能是甲醇参与了酯类物质的合成。

图5 芒果胡萝卜复合果酒发酵中甲醇的变化Fig.5 The changes of methanol contentduring fermentation of compound fruit wine

2.6 芒果胡萝卜复合果酒发酵过程中香气物质的动态变化

果酒的香气物质是影响果酒感官评价的重要因素,果酒的香气物质主要来自果实本身以及酵母的代谢,种类丰富,主要包括酯类、醇类、酸类、萜烯类等。果酒中的香气物质虽然含量很低,但是其种类多样,他们相互作用、相互补充,赋予了果酒独特的风味[22]。

图6 芒果胡萝卜复合果酒挥发性成分 GC-MS 总离子图 Fig.6 CG/MS total ion current ofvolatile flavor compounds of compound fruit wine

由表1可知,芒果胡萝卜果酒发酵过程中香气物质总的相对含量先升高后趋于稳定。芒果胡萝卜果汁(发酵0 d)检测出23种香气物质,相对含量为85.82%,其中醇类有3种,相对含量为3.53%;萜烯类有8种,相对含量为65.55%,其中相对含量最高的物质为3-蒈烯(17.02%),其次是萜品油烯(15.35%)和β-石竹烯(11.7%);酯类有8种,相对含量为10.63%;醛酮类有3种,相对含量为5.88%;酸类有1种,相对含量为0.24%。从检测出香气物质的相对含量我们可以看出,芒果胡萝卜果汁的主要香气物质是萜烯类,其中3-蒈烯和萜品油烯在很多芒果品种中被检出,是芒果特征香气物质[23]。3-蒈烯具有强烈的松木样香气;萜品油烯具有芳香的松木香气,微带甜的柑橘风味。β-石竹烯是胡萝卜的特质香气物质之一,具有淡的丁香似香味[24]。

表1 芒果胡萝卜复合果酒发酵过程中香气物质及相对含量的变化Table 1 Changes of aroma components and relative contents during fermentation of compound fruit wine

续表

在芒果胡萝卜果酒整个发酵过程(1～8 d)中检测出55种香气物质,其中醇类11种、萜烯类8种、酯类21种、醛酮类9种、酸类3种、其他类3种,以酯类、醇类物质为主。芒果胡萝卜果汁(发酵0 d),复合果酒在发酵过程中,由于酵母的代谢作用,醇类、酯类和醛酮类等香气物质的种类增加明显,其中苯乙醇是果酒醇类中主要的呈香物质,其具有柔和、愉快而持久的玫瑰香气;癸酸乙酯、月桂酸乙酯和辛酸乙酯是果酒酯类中主要的呈香物质,癸酸乙酯有果香和酒香香气,梨和白兰地似的香韵,是葡萄酒中的重要香气成分,月桂酸乙酯有花果香气辛酸乙酯有水果香气,并有菠萝、苹果样的香韵和白兰地的酒香味,是白兰地酒特有的香味物质[25]。

由图7可知,在芒果胡萝卜复合果酒酿造过程中,发酵液的主体呈香物质是不断变化的。芒果胡萝汁的主体香气成分是萜烯类(65.55%),随着发酵的进行,萜烯类的相对含量逐渐降低,酯类的相对含量逐渐升高,到发酵结束,酯类为成品果酒的主体香气物质(72.58%)。果酒的香气成分的变化与酵母的生长代谢密切相关,在发酵前期,酵母大量繁殖,初级代谢旺盛,产生的香气成分相对较少。随着发酵的进行,酵母的乙醇代谢占据主导,相应的发酵液香气物质醇类、酯类和酸类物质含量不断增加;在发酵后期,酵母进入衰亡期,乙醇代谢基本停止,此时发酵液中的酸类物质与醇类物质发生酯化反应,酯类物质成为主体香气成分,使得发酵液后期酒精度和总酸的含量略有下降[26],这与文中酒精度和总酸变化趋势相一致。

图7 芒果胡萝卜复合果酒发酵过程中香气物质相对含量的变化Fig.7 Changes of relative contents of aroma componentsduring fermentation of compound fruit wine

3 结论

在芒果胡萝卜复合果酒酿造过程中,发酵初期糖类物质被酵母迅速消耗转化成二氧化碳和酒精,酒精度明显升高,随着发酵时间的延长,糖类物质的减少,酵母代谢减缓,发酵液酒精度趋于稳定,最终果酒酒精度为13.37% vol。在发酵过程中总酸和挥发酸的含量呈先上升后平稳的趋势,酸类物质含量的升高,有利于后期果酒风味的形成,同时可以抑制杂菌的生长。发酵过程中总酚和干浸出物含量呈先上升后下降的趋势,其中总酚在发酵第3 d时达到最大值395.17 mg/L,干浸出物在发酵第4 d时达到最大值24.20 g/L。发酵过程中甲醇的含量迅速增加,在发酵第6 d是达到最大值103 mg/L,远低于国家标准(白葡萄酒250 mg/L)[27]。

芒果胡萝卜果汁经过酵母发酵后香气物质种类明显增多,果酒中共检出55种香气物质,香气物质总的相对含量先升高后趋于稳定,在发酵第6 d达到最大值为91.75%。芒果胡萝汁的主体香气成分是萜烯类,随着发酵的进行,酵母代谢活动增强,发酵液中醇类和酯类的增加,使得萜烯类的相对含量逐渐降低,酯类的相对含量逐渐升高,到发酵结束,酯类成为果酒的主体香气物质(72.58%)。最终得到的芒果胡萝卜复合果酒色泽橙黄饱满、透明清亮、有浓郁的果香和酒香、口感甘甜醇厚,在此实验的基础上后期可以进行芒果胡萝卜复合果酒中试实验以及工厂生产。