枳壳类中药材干燥果实DNA提取方法的优化实验设计

李明娟， 黄 嬛， 金 莉， 金佩芬， 黄越燕， 丁宝月

（1.嘉兴学院医学院，浙江嘉兴314001；2.嘉兴市食品药品检验检测院，浙江嘉兴314001）

0 引 言

实验教学在药学教学中占有较大比重，在药学人才培养中处于十分重要的地位，对培养学生的实验技能和创新能力有着不可替代的作用［1-5］。将学科前沿引入到实验教学中，可以引导学生更加有效地学习和运用基础知识，感受学以致用的乐趣，激发创新思维，培养创新能力［6-9］。

枳壳为常用中药，是芸香科植物酸橙（Citrus aurantiumL.）及其栽培变种黄皮酸橙C. aurantium‘Huangpi’、代代花C. aurantium‘Daidai’、朱栾C.aurantium‘Chuluan’、塘橙C. aurantium‘Tangcheng’的干燥未成熟果实。临床主要用于治疗胸闷胀痛、食积不化、痰饮、胃下垂、脱肛、子宫脱垂等症［10］。由于枳壳品种繁多、种植区域广泛，来源复杂，兼之以次充好、以假充真，使得同物异名、同名异物现象严重，枳壳交易市场混乱，为研究和临床用药带来不便。因此，如何有效、快速地鉴定枳壳成为一个亟须解决的问题。DNA分子标记技术在中药材鉴定中具有广泛的应用，具有微量、快速、准确、特异性强、对样本要求较低［11-13］的特点，能够弥补传统生药鉴定方法的不足。DNA提取是DNA 分子标记技术中关键的一步，能否顺利进行后续鉴定取决于提取的DNA 的质量。中药材是干品，且经炮制加工成碎片，很难用基原、外观、显微及理化等常规方法进行鉴别。中药材中的DNA 可能会在炮制和贮藏过程中受到破坏，存在不同程度的DNA降解现象。枳壳类中药材分子鉴定也同样存在上述问题［14］。因此，如何从枳壳类中药材干燥果实中提取高质量的DNA 成为其分子鉴定的一个难题。本实验的设计采用改良的DNA 提取方法对4 种枳壳类药材（朱栾、香橼、枳壳、代代花）的干燥果实不同部位进行DNA提取，比较提取质量，优化提取条件，有利于药学专业学生认识学科发展前沿、提升科研创新能力。

1 实验材料与方法

1.1 药 材

实验所用的4 种枳壳类栽培变种由浙江省食品药品检验研究院提供。样本信息详见表1。

表1 样品来源表

1.2 仪器与试剂

PCR相关试剂，快捷型植物基因组DNA提取系统（DP321）购于天根生化科技（北京）有限公司；引物由生工生物工程（上海）有限公司合成；实验中的仪器包括PCR 扩增仪BIO-RAD DNA Engine，核酸电泳仪Power Pac Basic，Bio-Rad 公司的凝胶成像系统Molecular Imager® Gel Doc TM XR ＋System。

1.3 实验设计

1.3.1 朱栾DNA的提取

以朱栾的干燥果实为取材对象，按照DNA提取方法的不同分为试剂盒组、改良组，每一组根据采样部位的不同分为外果皮、中果皮、囊及内果皮组。试剂盒组按照快捷型植物基因组DNA 提取系统（DP321）的操作说明进行DNA提取，改良组的提取方法如下：①取枳壳类药材样品组织约50 mg，研成极细粉（要求过120 目筛），装入5 mL EP管中。②在EP管中加入0℃超纯水，置于0 ℃冰箱浸泡约30 h，每隔10 h 换1次水。12 000 r/min离心5 min，用移液枪小心移去上清液，开盖置于40 ℃烘箱中晾干。③将缓冲液FP1和FP2 置于37 ℃水浴中预热约2 min（若天气炎热，此步骤可省略不做）。④在样品中加入1 000 μL 缓冲液FP1 和15 μL RNaseA（10 mg/mL），涡旋振荡1 min，60 ℃水浴20 min，每隔5 min 剧烈摇荡一次。⑤继续加入325 μL 缓冲液FP2，充分混匀，涡旋振荡1 min。⑥12 000 r/min离心5 min，将上清液转至新的离心管中。⑦重复⑥。⑧向上清液中加入0.2 倍2.5 M的NaCl 和0.7 倍体积的异丙醇，充分混匀，12 000 r/min离心2 min，弃上清液，保留沉淀。⑨加入600 μL 70%乙醇，涡旋振荡5 s，12 000 r/min离心2 min，弃上清液。⑩重复⑨。○1 开盖倒置，置于40 ℃烘箱彻底晾干残余乙醇。○12 加入50 μL 灭菌蒸馏水或超纯水溶解（60 ℃水浴助溶），期间颠倒混匀数次，最终得到DNA 溶液。○13 所得DNA 溶液可置于4 ℃冰箱备用，若长期不用可保存于-20 ℃冰箱中。

1.3.2 其余3 种药材DNA的提取

以3 种枳壳类药材香橼、胡柚、枳壳、代代花的干燥果实作为取材对象，取材部位均选取5 种药材的外果皮，按改良后的提取方法进行DNA提取。

1.4 提取DNA的浓度、纯度测定

取10 μL DNA样品，用超纯水稀释至60 μL，以超纯水为空白对照测定其浓度、A260／A280和A260／A230值，并记录数据。

1.5 DNA琼脂糖电泳

制备质量分数为1.5%的琼脂糖凝胶，8 μL DNA样品与2 μL上样液混合后加入加样孔中，电泳槽电压调至120 ～140 V，待loding buffer 跑到下游2/3 ～3/4处，关闭电源，将胶块浸没于EB 染色液中染色10min，取出后用清水漂洗数次，在凝胶成像系统中观察结果，拍照留存。

1.6 PCR扩增

以提取的DNA为模板，引物选取及扩增体系参照相关文献进行［3］，引物序列详见表2，PCR扩增体系详见表3。扩增程序为：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，共35 个循环；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶（EB染色）上电泳，用凝胶成像仪拍照，分析。

表2 PCR扩增引物序列

表3 PCR扩增反应20 μL反应体系

2 结 果

2.1 DNA提取方法的优化

朱栾是中药材枳壳的一种栽培变种，以朱栾外果皮为取材对象，分别按试剂盒操作和改良后的提取方法（以下分别简称为方法1 和方法2）进行DNA提取，由表4 可见，用改良的方法提取到的DNA 纯度较高，A260／A280值较接近标准值1.8，A260／A230的比值也在2.5附近，DNA琼脂糖电泳结果也证明改良方法提取到的DNA条带更清楚（见图1），说明改良后提取到的DNA纯度较高。虽然表4 中，试剂盒方法提取的DNA浓度较高，但是参照A260／A280及A260／A230的比值可以推断所含杂质较多，不代表真实的DNA浓度。

表4 不同方法提取朱栾外果皮DNA浓度和纯度检测结果

图1 不同方法提取朱栾DNA电泳图

2.2 样品取材部位的不同对DNA提取的影响

分别取朱栾外果皮、中果皮、囊及内果皮用改良后的方法进行DNA提取，稀释DNA提取液进行DNA浓度测定和琼脂糖电泳测定，以AW88 为引物进行ISSRPCR扩增，扩增产物进行电泳，检测结果见表5。

表5 不同取材部位提取朱栾DNA浓度和纯度检测结果

从表5 可知，DNA 提取液浓度顺序：外果皮＞内果皮＞囊＞中果皮；DNA 提取液A260／A280的值只有外果皮的最接近标准值1.8；DNA 提取液A260／A230的值外果皮2.64，比较接近标准值2.5；说明外果皮提取的DNA质量最好，浓度和纯度也均比其他部位高。

DNA电泳图（见图2）中，外果皮的条带最清晰明亮；内果皮次之；囊的条带较为模糊，难以辨别；中果皮无DNA 电泳条带出现。该结果说明外果皮提取的DNA质量最好。

图2 不同部位提取朱栾DNA电泳图

如图3 所示，外果皮DNA 的PCR 产物最清晰明亮，内果皮次之，中果皮和囊相近。这进一步说明外果皮提取DNA更适合朱栾分子鉴定的后续反应。

图3 不同部位提取朱栾DNA的ISSR-PCR电泳图

2.3 枳壳类药材DNA提取

选取3 种枳壳类药材香橼、枳壳、代代花作为实验对象，取材部位均选取5 种药材的外果皮，按改良后的提取方法进行DNA 提取，由表6 所示可见，不同品种的枳壳类药材，DNA 提取浓度稍有差异，纯度尚可，A260／A280的值均在1.8 附近。

表6 不同品种枳壳类药材DNA提取液的浓度和纯度检测结果

在图4 所示的PCR 产物电泳图中，5 条引物中AW88、AW90 均能使3 种枳壳品种的DNA 扩增出清晰明亮的多态性条带。AW102、AW103、AW241 引物扩增后为出现清晰条带。

图4 改良法提取3种枳壳类药材外果皮DNA的ISSR-PCR电泳图

3 实验教学效果

通过本实验，使学生掌握了干燥枳壳的DNA提取及优化方法。干燥中药材的DNA 受到了不同程度的破坏，易降解，因此实验设计时通过优化水浴温度、裂解时间、药材粉碎度及取材部位等因素，比较实验结果，让学生充分裂解中药材DNA 提取时的注意事项，掌握凝胶电泳、DNA浓度纯度测定等基本的分子实验技能，大大激发了学生的科研热情，培养了学生严谨的科学态度。

4 结 语

本实验中优化了枳壳类中药材干燥果实的DNA提取方法，并证实外果皮部分更适于提取DNA用于后续鉴定反应，为干燥中药材的DNA提取及分子鉴定提供了一定的参考。实验内容可行性较强，可在现有的实验室基础上开展，开拓了学生的科学视野，激发了学生对科学研究的浓厚兴趣。实验中加入了对各影响因素的优化，内容多样，并加入自主查阅文献及总结环节，提高了学生综合分析问题的能力。教学实践表明，学生非常喜欢参与到这类研究型实验，研究型实验可以将学生的专业课知识学以致用，在分析科学问题时进一步巩固所学到的专业基础知识。