益胃饮中药血清药物化学研究＊

董 宇，赵丽沙，吴人照，陈 伟，柴可群＊＊

（1.浙江中医药大学 杭州 310053；2.浙江省中医药研究院 杭州 310007）

中药血清药物化学是采用药物化学的研究手段和方法，利用现代分析技术鉴定口服中药及中药复方后血清中的移行成分，研究其药效相关性，确定中药体内直接作用物质，为中药及中药复方药效物质基础研究提供科学依据[1-3]。临床验方益胃饮是浙江省名中医柴可群主任医师长期防治胃癌复发转移的经验方[4]。方取健脾益气、袪瘀化痰、清热解毒三法，以黄芪、太子参、清半夏、鬼球、藤梨根等药组成，扶助正气，调和胃气，清毒抗邪，临床应用多年，效果良好，可延长胃癌患者生存期，提高患者生活质量。前期药理学研究表明益胃饮含药血清可抑制人胃癌细胞MFC增殖、迁移和侵袭能力[5]，诱导MFC细胞凋亡[6]；同时动物实验显示益胃饮可抑制小鼠移植性前胃癌术后复发转移能力[7]，初步对其药效作用机制进行了探讨。为深入研究益胃饮防治胃癌前病变及胃癌的药效物质基础，本研究采用中药血清药物化学的方法，通过超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱（UHPLCQ∕TOF-MS），将益胃饮水提物、益胃饮水提物灌胃给药大鼠后的含药血清以及空白大鼠血清进行分析比较，对益胃饮水提物及其主要入血成分进行分析，旨在揭示益胃饮体内作用物质基础，为益胃饮的药物开发和临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 设备与材料

SCIEX X-500R四级杆飞行时间质谱仪（美国AB SCIEX公司），TurboIonSpray离子源（美国AB SCIEX公司）；ExionLCAD高效液相色谱仪（美国AB SCIEX公司）；Beckman 20R低温高速离心机（美国Beckman公司）；IKA微型涡旋混合仪（德国艾卡公司）；AUW220D电子天平（日本岛津公司）。

图1 益胃饮水提物UHPLC-Q/TOF-MS总离子流图（A：正离子模式；B：负离子模式）

黄芪、浙麦冬、三叶青、姜半夏、蒲公英、麸白芍、藤梨根、薏苡仁和香茶菜购自杭州华东中药饮片有限公司，批号分别为170824、170818、170830、170804、170901、170715、170819、170723和170823。对照品精氨酸140624-201506、原儿茶酸110809-201205、原儿茶醛110810-201608、咖啡酸110885-200102、芍药苷110885-200102、毛蕊异黄酮苷111920-201606、甘草苷110610-200604、黄芪甲苷110781-201616和甘草酸15080510购于中国食品药品检定研究院。乙腈与甲酸（德国Merck公司）、Milli-Q超纯水（美国Millipore公司），其余试剂均为分析纯。

健康SPF级雄性Wistar大鼠12只，10-12周龄，体质量（200±20）g，购自浙江维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号SCXK（浙）2018-0001，适应性喂养1周，每天自由进食饮水。

1.2 方法

1.2.1 益胃饮水提物制备

取各药材适量，按比例配置，加入10倍量纯水浸泡30 min，加热回流提取3次，每次提取2 h，合并滤液浓缩，制得1.09 g·mL-1的益胃饮提取液。

1.2.2 益胃饮提取物供试品溶液和对照品溶液配制

取1.0 mL益胃饮提取液，置100 mL容量瓶中，加去离子水超声30 min，至浓缩液完全溶解，加去离子水补足，以13 000 rpm离心15 min，取上清液即为益胃饮供试品溶液；分别精密称取各对照品，用甲醇稀释近似1.0 mg·mL-1的对照品母液，分别取适量对照品母液，制备得混合对照品溶液，供UHPLC-Q-TOF-MS定性比较。

1.2.3 空白血清及含药血清样品的制备

图2 TCM MS/MSLibrary中药二级谱库比对示意图（A：咖啡酸；B：芍药苷；C：黄芪甲苷；D：甘草酸）

雄性SPF级Wistar大鼠12只，随机分成2组，一组按3.6 g·kg-1剂量灌胃益胃饮提取液，另一组空白组灌胃等体积的生理盐水。连续给药3 d，每天1次，分别于第3 d末次给药后1 h取样。戊巴比妥钠麻醉后，腹主动脉取血，离心分离制得益胃饮含药及空白血清，-80℃存放备用。

1.2.4 血清样品处理

血清置于室温下融化，取1.0 mL至离心管中，精密加入20μL磷酸，超声处理1 min，涡旋混匀30 s后上样到预先用3 mL甲醇和3 mL水活化平衡好的SPE柱上，以3 mL水淋洗，弃去，再以3 mL甲醇洗脱，收集洗脱液，室温下氮气吹干，残渣以100μL甲醇复溶，4℃13 000 rpm离心15 min，取上清液即为血清供试品溶液。

1.2.5 色谱和质谱条件

色谱条件：ACQUITY UPLCHSST3（100×2.1 mm，1.8μm）色谱柱，流动相为0.1%甲酸乙腈（A）-0.1%甲酸水（B），梯度洗脱程序：0-2 min 1%A；2-5 min，1%-20%A；5-13 min，20%-45%A；13-17 min，45%-100%A；17-20 min，100%A，体积流量0.3 mL·min-1。

质谱条件：飞行时间质谱采用TurboIonSpray离子源，ESI正负离子扫描模式。具体条件为：Ion Source Gas1（Gas1）：55，Ion Source Gas2（Gas2）：55，Curtain gas（CUR）：35，source temperature：600℃，IonSapary Voltage Floating（ISVF）：5 500 V∕-4 500 V（正负离子两种 模 式）；TOF MS scan m∕z range：50-1 500 Da，production scan m∕z range：25-1 000 Da，TOF MSscan accumulation time 0.15 s∕spectra，product ion scan accumulation time 0.05 s∕spectra；二 级 质 谱 采 用information dependent acquisition（IDA）获得，并且采用high sensitivity模式，Declustering potential（DP）：±60 V（正负离子两种模式），Collision Energy：35±15 eV，IDA设置如下Exclude isotopes within 4 Da，Candidate ions to monitor per cycle：10。

1.3 数据分析

采用SCIEX OS软件采集和处理数据。SCIEX OS软件包含多重置信标准，包括质量准确度，保留时间，同位素，以及化合物库的匹配使用。本实验根据化合物的一级精确质量数、同位素分布比和MS∕MS搜索SCIEX OS配置的中药二级数据库TCM MS∕MSLibrary（包含1 000多种中药化合物二级数据），即可在在无标准品的情况下完成对目标物的筛查。

2 结果与分析

表1 正离子模式下益胃饮水提物归属的化学成分

表2 负离子模式下益胃饮水提物归属的化学成分

图3 负离子模式下益胃饮水提物总离子流图（A）和混合对照品溶液总离子流图（B）

2.1 益胃饮水提物化学成分归属及其质谱裂解分析

按“1.2.2”项方法取益胃饮提取液供试品溶液进UHPLC-Q∕TOF-MS系统分析，得到益胃饮提取液总离子流图（图1）。

通过与SCIEX OS软件自带的中药二级数据库中化合物TCM MS∕MSLibrary的一级精确质量数、同位素分布比和MS∕MS比较与筛选（图2），在正离子模式下归属色谱峰53个（表1），在负离子模式下归属色谱峰55个（表2），去除重复的20个化合物后共归属色谱峰88个。通过购买对照品，对益胃饮水提物供试品溶液中的精氨酸、原儿茶酸、原儿茶醛、咖啡酸、芍药苷、毛蕊异黄酮苷、甘草苷、黄芪甲苷和甘草酸进行标准物质保留时间（tR）及二级碎片离子信息比对（图3），结果表明通过搜库鉴定化合物的结果稳定可靠，可用于中药中复杂化学成分的分析鉴定。

2.2 益胃饮血中移行成分分析

在益胃饮水提物化学成分分析的基础上，在SCIEX OS软件中输入上述分析鉴定的88个化合物的分子式和保留时间，根据目标化合物的一级精确质量数、同位素分布比和MS∕MS进行匹配，筛选在空白血清中未检出，而在含药血清中检测的化合物（见图4）。

经筛选鉴定，益胃饮含药血清正离子模式下共检出血中移行成分15个（表3），负离子模式下共检出血中移行成分20个（表4），去除8个重复化合物后共检出益胃饮血中移行成分27个。

3 讨论

益胃饮是分析历代医家对胃癌的认识及用药基础上，总结多年大量临床经验而得的经验方，具有健脾益气、袪瘀化痰、清热解毒之功效。在长期临床工作中，益胃饮治疗了大量胃癌患者，可减少胃癌术后复发与转移，明显提高患者生活质量，使不少胃癌进展期患者得以长期带瘤生存。虽然益胃饮临床使用卓有成效，但益胃饮的药物开发尚属于初步阶段，益胃饮的药效物质基础承待阐明。

图4 SCIEX OS软件筛选益胃饮水提物血中移行成分示意图（A：芍药苷；B：芒柄花素；C：甘草酸）

表3 正离子模式下益胃饮水提物血中移行成分

表4 负离子模式下益胃饮水提物血中移行成分

中药血清药物化学是阐明中药及中药复方药效物质基础的有力手段，其中超高效液相色谱四级杆飞行时间质谱（UHPLC-Q∕TOF-MS）具有强大的色谱分离能力和精准的质谱高分辨定性能力，已成为中药血清药物化学研究的首选方法[8-9]。本实验建立的UHPLC-Q∕TOF-MS益胃饮中药血清药物化学分析方法是可靠的定性分析方法，能够较全面地反映益胃饮水提物口服后吸收入血的药物成分，为快速确定益胃饮药效物质基础及代谢研究奠定基础。

为了获得分离度好、灵敏性高且信息量丰富的色谱图，本实验对色谱条件进行了优化。通过比较不同厂 家 色 谱 柱（Waters BEH C18、Waters HSS T3和Shimadzu Inetsil SPC18）对益胃饮水提物及血清样品的分离效果，最终选择Waters HSST3色谱柱；通过比较流动相系统，比包括4种流动相体系：乙腈-水、甲醇-水、0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水、0.1%甲酸甲醇-0.1%甲酸水，结果表明，使用乙腈体系流动相优于甲醇体系，并且添加0.1%甲酸有利于峰形的改善及质谱响应，最终选择0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水流动相体系；通过比较血清样品前处理方法，包括有机溶剂沉淀蛋白法、乙酸乙酯萃取法、热水浴法和SPE小柱萃取法，最终选择出峰较多，基质干扰较少的SPE小柱萃取法进行血清样品前处理。

本实验在建立UHPLC-Q∕TOF-MS方法的基础上，采用SCIEX OS软件进行数据采集和化合物谱库比较鉴定，可对中药复杂化学体系进行高通量和快速的鉴定，具有准确、高效、简单的操作特点[10]。通过SCIEX OS数据处理与鉴定，共归属益胃饮水提物中88个化合物，胃饮血中移行成分27个，主要包括氨基酸类，有机酸类，黄酮类，苷类和萜类化合物。研究结果为揭示益胃饮防治胃癌前病变及胃癌的药效物质基础提供实验基础，为益胃饮的药物开发和临床应用提供科学依据。