不同激活方法对金华猪单精注射胚胎体外发育的影响

屠平光，项 云，章啸君，胡旭进

(金华市农业科学研究院，浙江 金华 321007)

胞浆内单精子注射(ICSI)技术是一种体外受精技术，对于受精机理的研究、野生动物和濒临灭绝动物的保护、优秀公畜精子的利用，以及男性不育的治疗等方面具有重要意义。2000年，Martin采用体内成熟卵母细胞经ICSI首次得到存活的小猪。与其他物种相比，猪ICSI技术还不完善。由于ICSI避开了传统受精的精卵结合激活卵母细胞的过程，因此，与传统的受精过程不同[1]，胞质内显微受精不进行激活处理的卵母细胞，其体外发育率很低，不能发育到囊胚阶段，说明注射管的机械刺激不足以激活卵子[2]。而卵母细胞激活失败是ICSI受精失败的主要原因[3]。因此，卵母细胞激活对提高卵母细胞胞质内单精子注射的成功率具有重要作用[4-5]。不同的激活方法、激活剂的选择，对卵子激活后的卵裂率、囊胚发育率均有较大程度影响。本试验研究了采用不同激活方法对金华猪ICSI胚胎体外发育的影响，为后期开展核移植提供足量、优质的胚胎和高效、稳定的激活方法。

1 材料与方法

1.1主要试剂与仪器 试验所用试剂除特别说明外，均为sigma公司产品。卵母细胞成熟液为TCM-199基础培养液+10 IU/mL FSH+10 IU/mL LH+10%PFF+10%血清；融合/激活液由0.25 mol/L甘露醇，0.1 mmol/L氯化钙，0.1 mmol/L氯化镁，0.5 mmol/L HEPES以及0.01%PVA组成；胚胎培养液为NCSU-23+4 mg/mL BSA+10%血清。体视显微镜(Olympus TRPT-4045型)；CO2培养箱(Thermo311)；倒置显微镜(Olympus-CKX41)。

1.2金华猪卵母细胞的准备 卵母细胞体外成熟培养44 h后，放入含有0.1%透明质酸酶的洗卵液中，轻轻地用吸管吹打去掉颗粒细胞，挑选胞质饱满均匀、排出pbI的卵母细胞，用TCM-199培养液和获能液 (mTBM)洗3次，移入已平衡的mTBM微滴(50 μL)中，上覆石蜡油。每滴置卵母细胞18枚左右，放入CO2培养箱中备用。

1.3金华猪精子的准备 将新鲜采集的精液迅速带回实验室,用预热到37℃的BTS洗精液稀释,精子获能取0.5 mL稀释精液小心置于含有5 mL mTBM受精液的圆底试管底部,悬浮30 min后,将上层液吸出,离心洗涤及浓缩一次,取BTS重悬,使其浓度为1×106个/mL。按照精子预处理方法的不同,对重悬稀释的精子进行处理。(1)新鲜精子显微操作:直接移动BTS稀释的精子2 μL放置到准备好的加有6 μL 8%PVP微滴的操作盘中备用。(2)液氮一次冻融:用精液冷冻保护液稀释精液分装于0.5 mL细管中,放入液氮冷冻保存。用时60 ℃解冻,吸取2 μL放置到准备好的加有6 μL 8%PVP微滴的操作盘中备用。然后再离心沉淀，用BTS重悬至精子浓度为1×106个/mL,吸取2 μL放置到准备好的加有6 μL 8%PVP微滴的操作盘中备用。

1.4单精子显微注射受精(ICSI) 将精子加入ICSI培养皿中,选择一条活动力强、形态正常的精子，用注射针在精子尾部中下段，于尾部垂直按压，用力制动，将精子断尾部后，头部吸入注射针内，旋转微调升起降下注射针，将卵母细胞的极体置于12点或6点处固定。调节注射针在3点处，并紧贴卵膜。旋转针栓,将精子缓慢推向针头，当精子到达末端时，小心进针避免将卵子后壁损坏。回吸少量卵浆，卵膜破裂后，将精子注入卵浆。若卵膜破裂仍不明显，来回吸动卵浆，直到卵膜破裂后连同精子注入卵浆。精子注入卵浆内之前,必须抽吸少量卵浆,促进流入,增进卵母细胞激活。注射精子后，移出注射针，释放卵子，持卵针离开液滴，注射针离开皿底部。

1.5ICSI卵母细胞激活处理 注射卵在胚胎培养液滴中洗 3 遍后置于培养箱中培养 30 min，再依据实验设计对注射卵采用不同的辅助激活方法分四组处理：对照组，不激活；电激活组，采用 1.2 kV/cm，30 μs，2 次直流电(DC)脉冲；化学激活组，ICSI操作的卵子放入到添加了2 mol/L的6-DMAP作为激活剂的培养液中培养6 h；电+化学激活组，ICSI电激活后，在NCSU-23中培养4 h，然后转入到添加了2 mol/L的6-DMAP作为激活剂的培养液中培养6 h。

1.6计算胚胎体外培养及发育率 金华猪ICSI卵母细胞培养于NCSU-23胚胎培养液中，培养条件为 38.5 ℃，5% CO2、及饱和湿度的CO2培养箱中培养。第2 d 统计卵裂胚胎数,第7 d再次进行观察，统计囊胚发育情况。

1.7数据分析 用Graphpad Prism 5软件，对试验数据进行单因素方差分析。

2 结果

2.1不同激活方法对金华猪ICSI胚胎发育的影响 由表1可知，不同激活处理组与对照组比较，在卵裂率上无显著差异(P>0.05)，但在囊胚率上，电+化学激活组和电激活组与对照组和化学激活组比较，存在显著差异(P<0.05)。电+化学激活组和电激活组在囊胚率上无显著差异 (P>0.05)，对照组和化学激活组在囊胚率上无显著差异 (P>0.05)。

表1 不同激活方法对金华猪ICSI胚胎发育的影响

注：同列数据肩标不同字母表示差异显著(P<0．05)，肩标相同字母表示差异不显著(P>0.05)。

2.2精子不同处理方法对猪ICSI胚胎发育的影响 由表2可知，新鲜精子和冷冻精子经ICSI后卵子在卵裂率、囊胚率上无显著差异(P>0.05)。

表2 精子不同处理方法对金华猪ICSI胚胎发育的影响

注：同列数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05),肩标相同字母表示差异不显著(P>0.05)。

3 讨论

目前，常用的激活方法有化学激活和电激活，通常电激活与化学物质6-DMAP等联合应用，其激活效果更好。6-DMAP是一种蛋白质磷酸化抑制剂，它能阻止蛋白质磷酸化，能抑制成熟促进因子(MPF)和细胞静止因子(CSF)活性,从而使卵母细胞被激活,同时6-DMAP通过抑制纺锤体组装必须的磷酸化，导致纺锤体解聚，抑制第二极体排出，使卵母细胞形成二倍体雌原核[6]。因此，在ICSI卵母细胞经电激活处理和6-DMAP激活处理之间，有一个适当的时间间隔，能够有效的减少出现二倍体雌原核和孤雌发育的情况。电激活的原理是细胞在短暂高压直流电脉冲的作用下，膜上产生暂时的微孔，使细胞外钙离子通过微孔内流。Rho等研究表明，在ICSI卵经第1次激活后培养3 h后，再用6-DMAP处理,有利于第二极体的排出[7]。

本试验先用电激活ICSI卵母细胞，在培养液中培养4 h后，此时大部分ICSI卵母细胞已排出第二极体，再用6-DMAP激活，促进了原核的形成，并有效的避免了6-DMAP对第二极体排放的抑制作用，得到了较高的囊胚率。结果显示：新鲜精子和冷冻精子经ICSI后卵子在卵裂率、囊胚率上无显著差异(P>0.05)。电+化学激活组和电激活组与对照组和化学激活组比较，在囊胚率上均差异显著(P<0.05)。电+化学激活组在囊胚率上稍高于电激活组，但无显著差异 (P>0.05)，都可用于金华猪ICSI卵子激活的方法。