不同光周期处理对马铃薯组培苗生长和生理生化特性的影响

马永珍，王 芳,2,3,4,5，王 舰,2,3,4,5

（1青海大学，西宁 810016；2青海省农林科学院，西宁 810016；3青海大学省部共建三江源生态与高原农牧业国家重点实验室，西宁 810016；4青藏高原生物技术教育部重点实验室，西宁 810016；5青海省马铃薯育种重点实验室，西宁 810016）

0 引言

光是植物生长过程中的主要能量来源，同时光又是一个非常重要且十分复杂的环境因素。光照强度、光质及光周期都对植物的生长发育有着一定的影响[1]。在组织培养中，光照对培养材料的增殖和器官分化有重要影响。尤其对外植体细胞的最初分裂有明显的影响，另外，光强对培育壮苗也有许多益处[2]。马铃薯(Solanlum tuberosumL.)是茄科(Solanaceae)茄属(Solanum)双子叶多年生草本植物，是继水稻、小麦、玉米第四大世界粮食作物，也可作为蔬菜，同时，马铃薯还是加工业、化工原料和动物饲料的重要原料[3-4]。马铃薯喜光、喜冷凉性环境，对光周期和温度反应的敏感性是其影响资源引进是否成功的重要环境因子[5]。但目前由于马铃薯组培苗连续多代培养造成的种性退化、徒长、玻璃化和移栽成活率低制约了马铃薯产业化的发展，光照作为培养脱毒马铃薯组培苗的外部因素之一，直接影响培养材料的增殖、分化和生长。因此，开展光周期对马铃薯组培苗生长的影响具有一定的实际意义。

近年来，许多学者对于光周期对马铃薯生长的影响已经有一定的研究。张小川等[6]以青薯9 号马铃薯脱毒苗为材料，研究了不同光周期对马铃薯试管薯形成的影响。结果表明10 h/d的光照周期试管薯结薯效果最好，单瓶结薯率达到92%。龙维彪等[7]以米拉马铃薯为脱毒试管苗为试验材料，研究了不同光照对马铃薯试管薯形成的影响。结果表明全黑暗条件有利于促进米拉试管薯的形成，试管苗的结薯率、平均单薯重和每瓶结薯个数均较高；在光照强度为2000～2500 Lx时，4 h/d 的光照时间对试管薯诱导形成的效果最好。李秋琛[8]以弗乌瑞它马铃薯脱毒苗为材料，研究了光周期对微型薯生长发育的影响，表明在光照16 h黑暗8 h 处理下产量最高，薯块大，平均单薯重最重。刘梦芸等[9]以‘晋薯2 号’马铃薯原种为材料研究了光周期对马铃薯块茎的影响，结果表明，短日照处理可以促使块茎提早形成，但会使结薯率降低，植株茎叶生长受抑，块茎淀粉含量降低。

前人对马铃薯光周期方面的研究大多集中在马铃薯试管薯，微型薯以及块茎方面的研究[10-11]，而对于马铃薯组培苗的影响报道较少。因此，本研究以‘国外2号’、‘闽薯1号’以及‘青薯9号’马铃薯组培苗为试验材料，设置了3种不同的光照处理，研究探讨了不同光周期处理对不同马铃薯品种生长和生理特性的影响，以期为不同马铃薯品种组培苗筛选出最优的光照处理。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器设备MGC-300A 型智能光照培养箱、冷冻离心机(Bio-Rad)、恒温水浴锅(THZ-82)、新世纪T6 紫外可见风光光度计、电子精密天平PL203、电子天平ARB230、丰量牌电子数显游标卡尺(GB/1214)、直尺(20 cm)、移液枪(EPPendorf)、比色皿(0.5 cm、1 cm)、13 mL试管、计时器、1.5 mL离心管、纯水器(EPED)、漩涡混合器XW-80A、-80℃超低温冰箱(FORMA 900 SERIES)、SPEX Geno/Grinder2010 高通量动植物组织研磨机。

1.1.2 试剂 植物可溶性蛋白(SP)定量测定试剂盒(A045-2)、过氧化氢酶(CAT)测试盒(A007-1)、超氧化物歧化酶(SOD)测试盒(A001-1)、丙二醛(MDA)测试盒(A003-1)和脯氨酸(Pro)测试盒(A107-1-1)购自南京建成，浓硫酸由本实验室提供。

1.2 试验材料与处理

试验材料培养35 天的‘国外2 号’、‘闽薯1 号’和‘青薯9 号’组培苗为材料，由青海省农林科学院生物技术研究所提供。除顶，剪取2～3 cm 带叶茎段，接种MS 培养基(pH 6.0)，置于光照时长为8 h/d、12 h/d 和16 h/d 条件下；光照强度4950 Lx，温度昼夜18℃和16℃，湿度保持75%左右，每瓶接种5 株，每个处理接种42瓶，处理35天取样，3次重复，叶片混装在1.5 mL离心管中用于测定不同处理下的生理生化指标。

1.3 试验方法

1.3.1 指标测定 表型性状测定。鲜重、株高、茎粗、茎节数、叶片数、总根长和根数直接观察测量。

植株干鲜重测定。将试管苗用无菌水清洗，吸去表面的水分，称量鲜重；然后将植株放入锡箔纸中于105℃杀青40 min，85℃烘直至恒重，称量干重[5]。

生理生化指标测定。植物可溶性蛋白测定采用考马斯亮蓝法、过氧化氢酶测定采用可见光法、超氧化物歧化酶测定采用羟胺法、脯氨酸测定采用酸性茚三酮法，丙二醛测定采用TBA 法[12]；所有表型性状和生理生化指标均3次重复。

1.4 数据分析

数据处理与方差分析均采用均Excel 2007和DPS 9.50软件进行处理。根据灰色系统要求，3个光照处理的8 个生长表型性状指标组成一个灰色系统，每个品种的每一个光照处理作为系统中的一个因素。比较数列记为Xi(i=1、2、3、…、8)、Xi={Xi(1)、Xi(2)、…、Xi(8)}={鲜重、干重、株高、茎节数、茎粗、根长、根数、叶片数}构成的数列作为比较数列，选取各项指标的最优值记为参考列X0={X0(1)、X0(2)、…、X0(8)}。参照杨光华等[13]的方法计算关联系数、等权关联度和加权关联度。

首先采用极差法对原始数据进行无量纲化处理，根据公式分别求出各自的绝对离差、关联系数、等权关联度，采用灰色系统关联度理论的权重决策法，参考判断矩阵法给各指标赋权重，进而计算加权关联度。

绝对离差的计算见公式(1)。

关联系数的计算见公式(2)。

式中：min min|X0(k)-Xi(k) |为二级最小差，max max|X0(k)-Xi(k) |为二级最大差，ρ为分辨系数，其取值范围在(0，1］为提高其关联系数间的差异显著性，此处取值0.5，认为同等重要。

权重系数的计算见公式(3)。

等权关联度的计算见公式(4)。

加权关联度的计算见公式(5)。

2 结果与分析

2.1 不同光周期处理对马铃薯组培苗生长的影响

2.1.1 不同光周期处理对‘国外2 号’组培苗生长的影响 不同光周期对‘国外2号’马铃薯组培苗的鲜重、株高、茎节数、茎粗、根长、根数及叶片数影响如表1 所示。从表1 中可以看出，马铃薯组培苗的鲜重、干重、茎粗以及根长均随着光照时间的延长呈现增加的趋势，在16 h/d光照处理下鲜重、干重和根长分别为0.25 g、0.01 g 和9.33 cm，均显著高于8 h/d (P＜0.05)。在8 h/d光照处理下株高最高为5.60 cm，显著高于12 h/d和16 h/d(P＜0.05)。在12 h/d光照处理下根数最多为7 根，显著高于8 h/d (P＜0.05)。此外，不同光周期处理对茎节数、茎粗以及叶片数的影响不显著(P＞0.05)，但随着光照时间的延长16 h/d 光照处理下茎粗达到最大，相对于8h/d增加了23.42%。

2.1.2 不同光周期处理对‘闽薯1 号’组培苗生长的影响 不同光周期对‘闽薯1号’马铃薯组培苗的鲜重、株高、茎节数、茎粗、根长、根数及叶片数影响如表2 所示。从表2 中可以看出，马铃薯的鲜重和干重随着光照时间的延长，在16 h/d光照处理下显著高于8 h/d和12 h/d(P＜0.05)。株高在12 h/d 光照处理下显著降低(P＜0.05)，分别比16 h/d 和8 h/d 降低了44.80%和52.95%。茎节数在16 h/d光照处理达到最大为8个，显著高于12 h/d(P＜0.05)。茎粗随着光照时间的延长而增加，但不同处理之间差异不显著(P＞0.05)。根长和根数也随着光照时间的延长而有所增加，在16 h/d光照处理下达到最大，显著高于8 h/d(P＜0.05)。叶片数在16 h/d光照处理下显著高于8 h/d和12 h/d(P＜0.05)。

2.1.3 不同光周期处理对‘青薯9 号’组培苗生长特性的影响 不同光周期对‘青薯9 号’马铃薯组培苗的鲜重、株高、茎节数、茎粗、根长、根数及叶片数影响如表3所示。从表3中可以看出，马铃薯的鲜重和干重随着光照时间的延长，在16 h/d 光照处理下显著高于8 h/d和12 h/d(P＜0.05)。株高和茎节数不同处理之间差异均不显著(P＞0.05)，都在16 h/d 光照处理下达到最大为9.57 cm 和9 个。茎粗和根长随光照时间的延长而增加，在16 h/d 光照处理下达到最大为1.80 cm 和11.53 cm，均显著高于8 h/d(P＜0.05)。根数在12 h/d光照处理下达到最大，显著高于8 h/d(P＜0.05)叶片数在12 h/d 光照处理下显著高于8 h/d 和16 h/d(P＜0.05)。

表1 不同光周期对‘国外2号’马铃薯组培苗生长的影响

表2 不同光周期对‘闽薯1号’马铃薯组培苗生长的影响

表3 不同光周期对‘青薯9号’马铃薯组培苗生长的影响

2.2 光周期对马铃薯生长表型性状影响的综合分析

首先采用极差法对原始数据进行无量纲处理（表1、表2、表3），根据公式分别求出各自的绝对离差关联系数、等权关联度（表5），采用灰色系统关联度理论的权重决策法，参考判断矩阵法给各指标赋权重（表4），进而计算加权关联度。

通过公式采用判断矩阵法计算出各指标对应的权值，赋予各性状指标不同权重，其各品种的生长指标的权重系数均不同，‘国外2 号’马铃薯下生长综合性能各因子影响大小依次为：叶片数>鲜重>茎粗>茎节数>根数>干重>根长>株高；‘闽薯1号’马铃薯下生长综合性能各因子影响大小依次为：根数>茎节数>根长>茎粗>叶片数>鲜重>株高>干重；‘青薯9号’马铃薯下生长综合性能各因子影响大小依次为：叶片数>鲜重>株高>茎节数>茎粗>根长>根数>干重。从表中可以看出，随着光照时间的延长关联度也有所增加，‘国外2号’、‘闽薯1 号’和‘青薯9 号’均在16h/d 等权关联度和加权关联度都达到最大。这表明‘国外2号’、‘闽薯1号’和‘青薯9号’均在16h/d生长表型性状达到最优。

表4 各指标权重系数

表5 关联度以及排序

2.3 不同光周期处理对马铃薯组培苗生理生化的影响

2.3.1 不同光周期处理对可溶性蛋白含量的影响 不同光照处理对各品种的可溶性蛋白含量影响如图1 所示，从图中可以看出，‘国外2号’的可溶性蛋白含量随着光照时数的延长而增加，在16 h/d 光照处理下最大为107.95 gport/L，显著大于8 h/d 和12 h/d(P＜0.05)。‘闽薯1号’和‘青薯9号’的可溶性蛋白含量均在8 h/d光照处理下最大为24.71 和46.57 gport/L，显著大于12 h/d 和16 h/d(P＜0.05)。以上结果表明，在16 h/d 光照处理下可以显著促进‘国外2号’马铃薯可溶性蛋白含量的积累，在8 h/d光照处理下可以显著促进‘闽薯1号’和‘青薯9号’马铃薯可溶性蛋白含量的积累。

2.3.2 不同光周期处理对过氧化氢酶的影响 不同光照处理对各品种的过氧化氢酶(CAT)活性影响如图2 所示，从图中可以看出，‘国外2号’和‘青薯9号’的CAT活性均随着光照时数的延长而降低，在16 h/d 光照处理下显著低于8 h/d 和12 h/d(P＜0.05)。‘闽薯1 号’的CAT 活性在12 h/d 光照处理下最大为0.80 U/mgprot，显著大于8 h/d和12 h/d(P＜0.05)。

2.3.3 不同光周期处理对超氧化物歧化酶的影响 不同光照处理对各品种的超氧化物歧化酶(SOD)活性影响如图3所示，从图中可以看出，‘国外2号’的SOD活性在12 h/d 光照处理下显著高于8 h/d 和16 h/d(P＜0.05)。‘闽薯1号’的SOD活性在8 h/d光照处理下显著高于12 h/d和16 h/d(P＜0.05)。‘青薯9号’的SOD活性在16 h/d 光照处理下显著高于8 h/d 和12 h/d(P＜0.05)。

2.3.4 不同光周期处理对脯氨酸含量的影响 不同光照处理对各品种的脯氨酸(PRO)含量影响如图4所示，从图中可以看出，‘国外2 号’的PRO 含量在12 h/d 和16 h/d光照处理下显著高于8 h/d(P＜0.05)。‘闽薯1号’的PRO 含量随着光照时数的延长而降低，在16 h/d 光照处理下显著低于8 h/d和12 h/d(P＜0.05)。‘青薯9号’的PPRO 含量随着光照时数的延长而有所增加，在16 h/d光照处理下显著高于8 h/d和12 h/d(P＜0.05)。

2.3.5 不同光周期处理对丙二醛含量的影响 不同光照处理对各品种的丙二醛(MDA)含量影响如图5 所示，从图中可以看出，‘国外2号’的MDA含量随着光照时数的延长而降低，在16 h/d 光照处理下显著低于8h/d和12 h/d(P＜0.05)。‘闽薯1 号’的MDA 含量在16 h/d光照处理下显著高于8 h/d和12 h/d(P＜0.05)。‘青薯9号’的MDA 含量在8 h/d 光照处理下显著高于12 h/d和16 h/d(P＜0.05)。

3 结论与讨论

3.1 不同光周期处理对马铃薯组培苗生长表型形状的影响

光周期是植物对光环境变化所做出的响应，它对植物的生长发育过程至关重要[14]。有研究表明延长光周期可以提高芽苗菜油葵的株高与叶面积[15]，提高黄瓜幼苗的生长速率、茎粗与根冠比[16]，增加西葫芦幼苗子叶面积[17]，同时还能影响植物根茎伸长[18]。本研究中以马铃薯组培苗的鲜重、干重、株高、茎节数、根数、根长和茎粗为主要表型性状，对研究了不同光周期对不同马铃薯品种表型性状的影响，利用灰色关联分析法对不同光照处理下不同马铃薯品种生长表型指标进行综合评价，结果表明在16 h/d光照处理下‘国外2号’、‘闽薯1 号’和‘青薯9 号’的综合指标最优，这说明16 h/d 的光照处理有利于马铃薯组培苗的生长。这与前人研究结果基本一致[19-21]。

3.2 不同光周期处理对马铃薯组培苗生理生化的影响

‘国外2号’马铃薯的可溶性蛋白含量随着光照时数的延长而增加，在16 h/d光照处理下最高。’‘闽薯1号’和‘青薯9号’的可溶性蛋白含量均在8 h/d光照处理下最高。这表明16 h/d 光照处理下可以显著促进‘国外2号’马铃薯可溶性蛋白含量的积累，在8 h/d光照处理下可以显著促进‘闽薯1号’和‘青薯9号’马铃薯可溶性蛋白含量的积累。‘国外2号’的PRO 含量在12 h/d 光照处理下最高，‘闽薯1 号’的PRO 含量均在8 h/d光照处理下最高，‘青薯9号’的PRO含量在16h/d光照处理下最高。SOD、POD、CAT 是能够清除植物细胞内活性氧等自由基的主要保护酶。SOD 是一种源于生命体的活性物质，能够消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。POD 和CAT 则具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。MDA是植物受到逆境胁迫时膜脂过氧化作用的最终产物，它的积累会对生物机体产生毒害作用，它可与蛋白质分子结合，引起蛋白质分子内和分子间交联，使膜结构和功能受到破坏[22]。本研究结果得出，‘国外2号’和‘青薯9号’在不同光周期处理下，SOD 与CAT 没有一定的规律性，这可能是由于‘国外2号’和‘青薯9号’马铃薯两种氧化酶类对光周期不太敏感[21]。‘闽薯1 号’马铃薯的CAT 活性没有一定的规律性，但在12 h/d 光照处理下SOD活性最高，MDA含量积累最少，这表明‘闽薯1号’在12 h/d光照处理下抗逆性最强。

本研究中，‘国外2号’、‘闽薯1号’以及‘青薯9号’都随着光周期的延长综合生长性能有所增加，在16 h/d光照处理下，3 个品种的综合生长性能均达到最优。该光照处理较8 h/d 和12 h/d 更有利于马铃薯组培苗的生长。同时，在16 h/d光照处理下可以显著促进‘国外2 号’马铃薯可溶性蛋白含量的合成，在8 h/d 光照处理下可以显著促进‘闽薯1号’和‘青薯9号’马铃薯可溶性蛋白含量的合成。‘国外2号’和‘青薯9号’在不同光周期处理下，由于‘国外2号’和‘青薯9号’马铃薯两种氧化酶类对光周期不太敏感，SOD与CAT活性没有一定的规律性。‘闽薯1 号’马铃薯的CAT 活性没有一定的规律性，但在12 h/d 光照处理下SOD 活性最高，MDA 含量积累最少。此研究结论的得出，为进一步研究马铃薯光周期敏感性奠定了基础。