α6/α3β2β3乙酰胆碱受体在非洲爪蟾卵母细胞中的表达及其条件优化

施西子， 毛楷林， 朱晓鹏， 长孙东亭， 罗素兰

(海南大学热带生物资源教育部重点实验室∥海口市海洋药物重点实验室∥海南大学生命科学与药学院， 海口 570228)

烟碱型乙酰胆碱受体( Nicotinic acetylcholine receptor, nAChRs)是一类重要的配体门控离子通道，它们广泛存在于动物与人体内，具有重要的生理功能和临床意义[1]. 按其组织分布及功能可分为两大类：一类是遍及外周神经和中枢神经的神经元受体，它们参与快速突触传递. 另一类是介导神经肌肉传递并位于神经-肌肉接头处的肌肉型受体. nAChRs是五聚体跨膜蛋白，由5个相同或不同的亚基互相组合形成功能各异的不同亚型. 目前，已发现的神经型亚基包括α(2～10)和β(2～4)，共12种[2]. 这些亚基可以形成同型五聚体和异型五聚体. 同型五聚体由5个相同的α亚基构成，而异型五聚体为α亚基与β亚基等共同组合而成[3]. 各个亚型的结构非常相似，但它们的生理学和药理学功能却截然不同. 因此，急需发现能区分各个亚型的高选择性分子探针或工具药. 每个亚型的高选择性阻断剂或激动剂(配体)将有可能直接开发为与之相关的某种疾病的治疗药物. 建立nAChRs各个亚型的体外表达技术体系和实验模型，对于受体功能的研究与新型药物的筛选至关重要.

α6是nAChRs中的一类重要亚基，它在高等动物中枢神经系统中的几个重要区域都有表达，包括下丘脑和上丘、视神经、内侧缰核、腹侧膝状体、纹状体、椎弓根间核和脊髓背角等[4-8]. α6亚基所组成的亚型在调节纹状体多巴胺释放中起关键作用[9-10]，并与基底神经节相关疾病，如：成瘾、帕金森综合征等有关[11-12]. 目前，α6亚基参与组成的2种重要亚型分别是α6β2β3和α6β4. α6β2β3受体的天然存在区域非常局限，因为这些受体仅在非常有限的大脑区域中以低水平表达，并且α6β2*表达始终伴有大量其他nAChR亚型的表达并被遮盖，与此同时，α6β2β3在体外也难于表达. 而α6亚基与α3亚基具有高度的同源性，特别是胞外配体结合区域，发现特异作用于α6β2*并能区分其他亚型、特别是能区分α6β2*与α3β2*的配体和先导药物，对于研究相关疾病的发病机理和治疗新药的研发至关重要. 在体外表达实验中，为了提高α6β2*的表达，研究者利用嵌合体技术构建了α6/α3亚基，建立了α6/α3β2β3(简写为α6β2*，*代表其他亚基)亚型的体外表达模型[13],即方法主要利用α6亚基胞外配体结合区域与α3亚基的跨膜和胞内部分形成的嵌合体α6/α3，在保留了α6亚基的配体结合域的同时，提高了受体的表达. 虽然该方法实现了α6β2β3亚型的体外表达，但由于亚基存在不正确组装、表达不稳定和电流过小等因素，使得稳定表达该模型仍面临一些挑战[14]，这也限制了基于该受体活性化合物的筛选等工作. 因此，本文拟对α6/α3β2β3 nAChRs亚型进行体外重组表达研究，并对表达条件进行优化.

1 材料与方法

1.1 实验材料、试剂与仪器

包含 nAChRs亚基 α6/α3、β2、β3基因的质粒获赠于美国犹他大学( Salk Institute，CA， USA); 大肠杆菌(E.coli)DH5α，本实验室保存; 雌性非洲爪蟾(Xenopuslaevis) 购自美国 eNaso公司，实验所用的爪蟾均已在(17±1)℃温度下于实验室饲养3月以上. 限制性内切酶(SalⅠ、AflⅢ和NheⅠ)，MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0购于宝生物工程(大连)有限公司；质粒提取试剂盒(Omega)、胶原酶、乙酰胆碱购于Sigma公司；体外转录试剂盒mMESSAGE、mMACHINE T7 kit和MEGAclearTMTranscription Clean-Up Kit 购于美国Thermo Fisher Scientific公司；OR2 溶液(82.5 mmol/L NaCl，2.0 mmol/L KCl，1.0 mmol/L MgCl2，5 mmol/L HEPES，pH 7.5); ND96 溶液(96 mmol/L NaCl，2.0 mmol/L KCl，1.0 mmol/L MgCl2·6H2O，1.8 mmol/L CaCl2·2H2O， 5 mmol/L HEPES，pH 7.5);其他试剂与抗生素均为国产分析纯试剂.

分光光度计(Bio-RAD Smart SpecTMPlus)、膜片钳(Axon 900A，Molecular Devices, USA)、微电极拉制仪(P97, Sutter)、显微注射仪(Nanoliter 2000, Sutter)、研究级体视显微镜(SZX-ILLD2-200,OLYMPUS)、恒温恒湿细胞培养箱(KCL-2000A, EYELA)、小型水平电泳仪(Bio-Rad)、凝胶成像系统(ALPHA, Protein Simple)和灌流系统(ALA Corp.)等.

1.2 受体亚基质粒的提取和酶切

包含鼠源(Rat, r)nAChRs亚基α6/α3、β2、β3基因的质粒保存于E.coliDH5α菌株中. 菌种可放置于-80 ℃长期保存. 在提取质粒之前，先将菌种活化后，接种至100 mL LB液体培养基中，37 ℃摇床过夜培养12 h后，用质粒抽提试剂盒大量提取其质粒. 将提取出的质粒用限制性内切酶使其线性化[15]. 取1 μg质粒DNA、2 μL 10×Enzyme Buffer、1 μL Enzyme以及适量灭菌ddH2O进行酶切，酶切反应体系为20 μL. 不同亚基的限制性内切酶见表1. 酶切完全后，利用MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0试剂盒对酶切产物进行纯化，具体操作流程见试剂盒手册，每次的DNA片段(50 bp～20 kb)纯化量可达1.5～2.0 μg. 纯化后产物用琼脂糖凝胶电泳检测，用紫外分光光度计测定线性化质粒模板的浓度.

表1鼠源α6/α3、β2、β3nAChRs亚基质粒对应的限制性内切酶

Table1Therestrictionendonucleaseofplasmidwhichcontainedα6/α3,β2,β3nAChRssubtypes(rat)

包含的亚基质粒载体启动子限制性内切酶rα6/α3pT7TST7SalⅠrβ2pGEMHET7AflⅢrβ3pGEMHET7NheⅠ

注:r为大鼠(rat)来源.

1.3 cRNA的制备

以线性化的质粒DNA作为模板，利用T7体外转录试剂盒进行体外转录，获取对应亚基的cRNA. 体外转录试剂盒存于-80 ℃，使用前需将试剂管取出并置于4 ℃冰上，将10× Reaction Buffer 放置于室温下，待试剂完全溶解后，短暂离心以防试剂粘壁. 取无RNase离心管，依次将线性化质粒DNA模板、10×Reaction Buffer、2×NTP /CAP、Enzyme Mix、无RNase ddH2O加入管内，彻底混匀后短暂离心，密封离心管，将其置于37 ℃水浴锅，反应1～6 h(不同基因的反应时长不等).

转录完成后，使用RNA纯化试剂盒(MEGAclearTMTranscription Clean-Up Kit)对产物进行纯化. 具体操作见试剂盒手册. 取2 μL 制得的cRNA于2%琼脂糖凝胶电泳中进行检测，另取1 μL RNA用分光光度计测定其纯度与质量浓度，将制备所得的cRNA，稀释分装为0.3、0.5、0.8 μg/μL 3种规格，置于-80 °C 保存备用.

1.4 非洲爪蟾卵母细胞的获取

取性成熟非洲爪蟾，置于冰上1 h左右麻醉后，解剖取其卵母细胞[16]. 将取出的卵母细胞团块置于OR2溶液中反复清洗，清洗过程中尽可能把卵细胞团块用机械力分开，清洗干净的卵细胞加入至20 mL OR2溶液中，并加入称好的20 mg 胶原酶进行酶解. 酶解消化过程中，注意观察细胞团块的消化程度，避免酶解过度使得蛙卵易破裂. 消化40 min～1 h后，用OR2溶液多次洗涤已经酶解分开的单个卵母细胞，清洗到溶液不再浑浊为止. 选取黑白分明的单个蛙卵细胞，置于含抗生素(分别加入青霉素10 μg/mL、链霉素10 μg/mL、庆大霉素100 μg/mL )的ND96 溶液中培养. 于恒温恒湿培养箱中17 ℃培养12 h后，选取生长状态良好的蛙卵细胞进行显微注射.

1.5 显微注射

使用硅酸盐玻璃针(内径0.69 mm，外径1.2 mm) 拉制玻璃电极和注射针. 注射针尖端抛光，直径10～15 μm. 在注射针中灌入矿物油，将制得的各亚基的cRNA根据其质量浓度进行等量混合后，吸入注射针内，再注射到非洲爪蟾卵母细胞内. 如：各取1 μL质量浓度为0.3 μg/μL的α6/α3、β2、β3亚基的cRNA以1∶1∶1的比例等量混匀，则1 μL的cRNA混合液中，每个亚基的质量浓度为0.1 μg/μL. 依次类推，获得单个亚基质量浓度为0.10、0.17、0.27 μg/μL的cRNA注射液. 注射体积分为46.0、50.6、55.2 nL(显微注射仪以2.3 nL为一个注射单位). 将注射后的蛙卵置于60 mm培养皿中，加入灭菌后含抗生素的ND96溶液，置于17 ℃培养箱培养. 注意每天更换新鲜的含抗生素培养液. 培养3 d后，利用双电极电压钳技术进行检测.

1.6 电生理实验数据采集

室温条件下，吸取单个蛙卵置于细胞槽中(体积为50 μL)，灌流液ND96(含0.1 mg/mL BSA)，灌流速度2 mL/min. 电极针中灌满3 mol/L KCl溶液，电阻在0.5～2.0 MΩ. 当电极尖端进入细胞槽液面后，在IC模式下，双电极入液后，电压调零. 调零后，将2个电极轻轻刺入卵母细胞，将程序转换至TEVC模式，设置钳制电压为-70 mV，采样频率为Slow 100 Hz，Filter 10 Hz[16]. 用Clamp 10.2软件记录下电流情况. 蛙卵在1 min的记录时间内，给予2 s的ACh(100 μmol/L)激活，检测通道的表达情况. 记录时，一组数据包含3个连续的灌流，每个灌流时长为1 min. 每个灌流起始时，给予2 s的ACh(100 μmol/L)激活，记录诱导电流的表达情况. 电流稳定后，用α6/α3β2β3 nAChRs专一性拮抗剂α-芋螺毒素TxIB检测受体表达情况. 将5 μL(浓度为10-5mol/L)TxIB加入到容量为50 μL的细胞槽中，孵育5 min，记录给药后电流值，给药前后电流值的比值即为该受体亚型下α-芋螺毒素的阻断率.

ACh 诱发的内向电流为3～6个蛙卵所记录的平均值，利用 Clampfit 10.2 软件对结果进行分析，利用 Graphpad Prism 软件对结果进行作图，以最高浓度1 000 μmol/L的ACh激活通道开放的电流为分母，计算不同 ACh 浓度对应的反应率，即 Response(%). 将各浓度下的反应率(Response，%)输入 Graphpad Prism 软件进行作图[15].

1.7 条件优化设置

为找到α6/α3β2β3 nAChRs的最优表达条件，本研究将从蛙卵团块酶解时间、注射单个亚基cRNA的质量浓度与单次cRNA注射总体积、ACh 浓度这几个方面来进行比较. 蛙卵细胞酶解时间分别为45、50、55 min；单个亚基cRNA注射的质量浓度分别为0.10、0.17、0.27 μg/μL；注射cRNA总体积分别为46.0、50.6、55.2 nL；ACh 浓度分别为0、10、50、100、200、500、1 000 μmol/L.

2 结果与分析

2.1 nAChR亚基质粒的制备和酶切

提取的 α6/α3、β2、β3亚基基因质粒于0.8%琼脂糖凝胶电泳检测质粒纯度，结果如图 1 所示，M泳道是DNA maker DL 10 000，泳道1、2分别为rα6/α3 酶切前与酶切后，泳道3、4分别为rβ2酶切前与酶切后，泳道5、6分别为rβ3 酶切前与酶切后. 图1可见：泳道1、3、5的质粒纯度高，完整性好，适合进一步酶切线性化. 质粒DNA的质量浓度均在0.30 μg/μL以上(表2). 图1中泳道2、4、6为质粒酶切产物的纯度检测，可见环状质粒已经完全线性化，只显示了一条清晰的DNA条带，未见其他杂质. 与环状质粒的条带进行对比，发现线性化后的DNA具有明显滞后性，且线性化产物的质量浓度约为0.20～0.30 μg/μL (表2).

2.2 cRNA的制备和检测

体外转录完成后的纯化产物，取样2 μL于2% 琼脂糖凝胶电泳检测制备所得cRNA的纯度，结果如图2所示，其中泳道M为DNA marker DL 15 000，泳道1～3分别为α6/α3、β2、β3的cRNA. 经测定，3种亚基α6/α3、β2、β3的cRNA质量浓度分别为0.88、0.83、0.92 μg/μL(表2). 制备所得的各亚基cRNA分别分装为0.3、0.5、0.8 μg/μL 3种规格，置于-80 ℃保存备用.

M: DNA Marker DL 10 000; 1: rα6/α3 质粒; 2: rα6/α3 质粒经SalⅠ酶切后; 3: rβ2 质粒; 4: rβ2 质粒经AflⅢ酶切后; 5： rβ3 质粒; 6：rβ3 质粒经NheⅠ酶切后

图1 含有nAChRs亚基基因的质粒及其酶切线性化产物的电泳图

Figure 1 The agarose gel electrophoresis of nAChRs plasmids and their linearized DNA

表2 nAChRs亚基r α6/α3、r β2、r β3 基因的质粒、线性化 DNA 和体外转录 cRNA的质量浓度Table 2 The concentration of nAChRs subunit α6/α3, β2 and β3 plasmid, linearized DNA and cRNA

M:DNA Marker DL 15 000;1:rα6/α3 cRNA;2:rβ2 cRNA;3:rβ3 cRNA

Figure 2 The agarose gel electrophoresis of rα6/α3, rβ2 and rβ3 cRNA

2.3 非洲爪蟾卵母细胞的筛选

对比蛙卵团块的不同酶解时间可发现(图3)，以50 min 左右的酶解效果最佳，此时的蛙卵颗粒颜色鲜亮，弹性良好且多为单个的游离状，蛙卵表面无附着卵巢膜与滤泡膜(图3A). 酶解时间为45 min时出现团块状的卵母细胞，蛙卵黏连在一起，蛙卵外部包裹的透明部分是未能完全去除的卵巢膜与滤泡膜(图3B). 酶解时间55 min时，蛙卵过度酶解，虽然无黏连与薄膜，但细胞膜变软失去弹性(图3C). 蛙卵的质量对α6/α3β2β3 nAChRs 的表达有较大影响，宜选用两极分明的成熟蛙卵(图3D)，注射时挑选酶解50 min的蛙卵来满足实验条件的要求.

2.4 α6/α3β2β3 nAChRs亚型表达检测

使用等比混匀后的cRNA注射，单个亚基的质量浓度分别为0.10、0.17、0.27 μg/μL，注射体积分别选择46.0、50.6、55.2 nL，比较单个亚基cRNA质量浓度和单次注射总体积对电流表达情况的影响，结果如图4A. 从图4A可见:当cRNA质量浓度为0.10 μg/μL时，3种注射体积下的蛙卵均不能表达受体；cRNA质量浓度为0.17 μg/μL时，只有注射体积大于50.6 nL时部分蛙卵可检测到少量电流，此时单个蛙卵内单个亚基的cRNA注射量为8.4 ng；当注射质量浓度为0.27 μg/μL时，3种注射体积下均可以表达受体，此质量浓度下,单个蛙卵内每种亚基的cRNA注射量分别为12.27、13.49、14.72 ng. 当质量浓度为0.27 μg/μL、注射体积为55.2 nL时，表达受体的情况最佳.

ACh激活α6/α3β2β3 nAChRs的剂量效应曲线显示(图4B)：ACh的半最大效应浓度(Concentration for 50% of Maximal Effect, EC50)为100 μmol/L左右. 注射质量浓度与体积优化前的蛙卵，电流普遍较小(图4C)，而优化后，蛙卵的电流明显增加，较优化前提升了近6倍，200 μmol/L ACh作用下的电流最高可达600 nA左右(图4D)，更高浓度的ACh(1 000 μmol/L)激活受体产生的电流最高可达800 nA，但受体易脱敏.

图3 非洲爪蟾卵母细胞的酶解效果图

图4 单亚基 cRNA质量浓度、注射体积和ACh浓度对α6/α3β2β3受体电流表达的影响

Figure 4 The effect of cRNA concentration (single subunit), injection volume and ACh concentration on the current of α6 / α3β2β3 receptor

成功表达α6/α3β2β3亚型后，利用α6/α3β2β3亚型专一的拮抗剂α-芋螺毒素 TxIB[17]进行了受体敏感性的检测，图5A为ND96对照组. 结果(图 5B)显示：1 μmol/L TxIB对α6/α3β2β3 亚型的阻断率约为14%，且洗脱速度快，与文献[17]中的结果一致，说明受体具有良好的生理功能与敏感性.

图5 α-芋螺毒素 TxIB对α6/α3β2β3 nAChRs 的阻断情况

注:箭头所指为药物阻断后电流.

3 讨论

烟碱乙酰胆碱受体作为一类重要的配体门控离子通道，广泛分布于肌肉、中枢和外周神经系统，可参与调节生物体一系列的生理功能，如学习、记忆、应答、镇痛、兴奋和睡眠等[18]. 其各种亚型已作为相关疾病治疗新药研发的重要靶点[19-21]. 为了研究nAChRs结构与功能以及其体外活性表达，目前国内外大都采用非洲爪蟾卵母细胞作为外源受体和通道蛋白的表达系统[22-23]，并结合显微注射技术和双电极电压钳技术检测受体的体外表达情况. 现已成功在体外表达了α3β2 nAChRs[15]、α4β2 nAChRs[24]和α7 nAChRs[16]等多种乙酰胆碱受体. α6β2β3作为nAChRs中重要的一种亚型，在神经生理和病理过程中发挥重要作用，也是药理学研究和药物研发的重要靶点. 但作为体外较难表达的一种受体亚型，α6β2β3一直存在体外表达率低且表达电流小等诸多问题，尚无对其表达优化的相关研究.

含α6 亚基的nAChRs 与许多中枢神经系统疾病有关，其主要表达于与奖惩途径和运动行为有关的多巴胺能神经元以及于去甲肾上腺素能神经元、视觉系统和其他一些区域[14]. α6亚基的组装模式多变且复杂，故在最早期的尝试中、异源系统的表达只能进行简单的亚基组合，而这样的受体在体外表达时通常表达量较低且几乎没有功能活性[25]. 为了增加功能性表达，后来的研究利用α6/α3嵌合亚基成功实现了与β2、β3的共表达，所形成的α6/α3β2β3受体与天然受体具有相似的结合活性，可以作为体外药物筛选的模型[13,26].

本实验通过优化实验条件，期望在非洲爪蟾卵母细胞建立稳定高表达的α6/α3β2β3 nAChRs受体模型. 实验结果表明：对于α6/α3β2β3 nAChRs表达起决定性的因素是卵母细胞的酶解过程与cRNA的注射量. 酶解时间直接影响卵母细胞的质量，当酶解不完全时，细胞表面黏连的卵膜会影响cRNA注射，且残留的卵膜会影响电流检测，细胞膜上表达的受体通道蛋白与ACh 并未完全接触，这是导致检测电流小的原因之一；而当酶解过度时，外观上蛙卵细胞无残留的卵膜，但在cRNA注射时发现细胞膜失去弹性，注射过后大量细胞内容物由注射孔流出，蛙卵细胞存活时间普遍较短；酶解时间控制在50 min左右时，蛙卵细胞分散度高，死亡细胞较少，细胞膜弹性佳，利于后续的受体表达.

优化cRNA注射体积发现，cRNA质量浓度高且注射体积大更有利于受体的表达，随着注射体积增大，也会影响蛙卵细胞内外压力，造成蛙卵细胞破裂. 因此，注射体积不可过度增加，控制在55.2 nL以内较适宜.

每个亚基的注射量是影响受体表达的关键因素，每颗蛙卵内单个亚基cRNA的注射量超过8.4 ng时，蛙卵即可表达出受体，但电流很小. 由于α6/α3β2β3 nAChRs五聚体的组装模式为(α6/α3)2(β2)2β3，因此，提升单个亚基cRNA的注射量是有效提高表达的措施. 当单个亚基cRNA的注射量达到13.5 ng及以上时，蛙卵已经可以稳定表达α6/α3β2β3 nAChRs，且电流值较大，易于检测. 需注意的是，非洲爪蟾卵母细胞的质量与其本身生长发育和健康状况密切相关，蛙卵能承受的注射体积也会有差别，因此实验过程中宜针对实际情况进行微调以达到最佳效果，确保单个蛙卵内单个亚基的cRNA注射量在13.5 ng以上即可.

检测电流时，ACh浓度对电流大小产生直接的影响，浓度过低时无法有效激活通道产生稳定电流；而浓度太大时，虽可以产生大电流，但会使通道因为过度开放而失活脱敏，不利于目标化合物的筛选. 为了模拟体内正常的生理过程，且保证有效激活α6/α3β2β3 nAChRs通道开放，在体外实验应选用ACh的浓度为100 μmol/L，较α9α10 nAChRs亚型(10 μmol/L)的ACh诱导浓度高了10倍[27]，与α3β2 nAChRs 亚型的诱导浓度(50～200 μmol/L ACh)基本一致[15]. 此外，本实验cRNA注射体积控制在55.2 nL为最佳，这与房立丛等[16]体外表达α7 nAChRs亚基的结果不一致，在表达α7 nAChRs 亚基时，cRNA在3种注射剂量(41.4、50.6、60.9 nL)均表达出受体，但以41.4 nL注射量下的卵母细胞表现最佳，且存活时间最长；而注射量为50.6、60.9 nL时，分别会出现不同程度的卵细胞破损而影响α7 nAChRs亚基的表达水平[16]. 而这种差异的产生可能与蛙卵的大小与质量、受体亚基的类型或各自所用的cRNA纯度或质量浓度有关，有待进一步研究.

4 结论

本研究成功地在非洲爪蟾卵母细胞上建立了α6/α3β2β3 亚型的表达模型，并对表达条件进行了优化. 研究表明：爪蟾卵母细胞的最佳酶解时间为50 min 左右，以显微注射单个亚基cRNA质量浓度为0.27 μg/μL、注射体积为55.2 nL时，α6/α3β2β3 亚型在体外表达情况最佳. 为保证受体的良好表达，需保证每个蛙卵内单个亚基的cRNA注射量大于13.5 ng. 选择的检测条件为100 μmol/L ACh，优化后的α6/α3β2β3 亚型的表达率基本稳定在85% ，电流可基本稳定在300～400 nA左右，上阳性药阻断后易洗脱，可以用于后续的药物筛选与分子探针的研究. α6/α3β2β3 nAChRs 体外表达模型的成功建立不仅为以后针对2种受体的区分提供研究的基础，也为新药筛选提供了有效的模型；所建立的实验方法也可以为其他未能表达的模型提供一个借鉴，具有重要的意义.