异源表达花生基因AhGLK1对拟南芥glk1glk2突变体表型特征及抗旱性的影响

刘 星， 苏良辰， 张拜宏， 曾丽丹， 李媚娟， 李 玲*

(1. 遵义医科大学珠海校区生物工程系，珠海 519041； 2. 华南师范大学生命科学学院∥广东省植物发育生物工程重点实验室， 广州 510631)

GARP转录因子是植物特有的一类转录因子，在植物生长发育、激素信号转导、器官发生如(根和芽的发育)、抗病性、营养和维持昼夜节律等方面有着十分关键的作用[1]. 拟南芥GARP家族有56个成员，包括G2-LIKE基因和编码具有N末端接受结构域的B型ARR蛋白的基因[2].GLK基因首次在玉米中发现，g2突变体植株黄化[3]. 随后发现水稻、拟南芥、番茄和辣椒中存在与之同源的GLKs，这些GLK基因都具有可变剪接的转录本和功能冗余的特点[4-6]. 拟南芥存在GLK1和GLK2两个转录本，单突变体叶色与野生型一致，glk1glk2突变体叶色为浅绿色. GLK成员可与叶绿素合成及光合作用相关基因(如LHCB、HEMA)的启动子直接结合而调控叶绿素的合成、叶绿体的发育和光合作用.

本课题组前期通过花生组蛋白去乙酰化酶AhHDA1 (ArachishypogaeaL. Histone deacetylase 1)酵母文库，筛选到一个转录因子与之互作，命名为AhGLK1 (ArachishypogaeaL. Golden2-like 1). AhGLK1定位于细胞核，花生栽培种基因组中仅发现1个GLK基因. 进化分析表明，AhGLK1与野生大豆(GsGLK)、棉花(GrGLK)、苜蓿(MtGLK)、杨树(PeGLK)、烟草(NsGLK)的氨基酸序列相似性较高，其中AhGLK1与GsGLK相似度达97%，与拟南芥中AtGLK1和AtGLK2的相似度分别达56%和59%[7]. 为探究AhGLK1基因的功能，本研究将AhGLK1在拟南芥glk1glk2突变体异源表达，观察回复株系拟南芥表型特征和抗旱能力，发现AhGLK1通过影响叶片数量、形态发育以及光合作用提高拟南芥抗旱能力. 本文结果为进一步深入探讨花生AhGLK1基因在抗旱中的作用奠定了基础.

1 材料与方法

1.1 拟南芥植株的培养

拟南芥哥伦比亚生态型Col-0(野生型)和glk1glk2突变体种子由实验室保存，AhGLK1/glk1glk2株系由本实验室筛选获得：采取同源重组方法构建花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S启动子(Pro35S)驱动表达载体AhGLK1-eGFP，转化大肠杆菌，筛选单克隆阳性菌株，经测序成功后，扩大培养提取质粒，转化GV3101根癌农杆菌(AgrobacteriumTumefaciens)，侵染glk1glk2拟南芥. 经抗性筛选和PCR鉴定，获得T3代纯种AhGLK1/glk1glk2株系.

取不同株系拟南芥种子适量，加入灭菌水浸泡1 min. 弃水加入10%次氯酸钠浸泡8 min. 加灭菌水轻弹混匀，弃上清液后加75%乙醇清洗30 s，弃上清液，重复清洗1次. 再用灭菌水清洗5次，加1 mL水吹打混匀后，转到1/2 MS固体培养板中. 置于4 ℃避光层极处理2 d后，转到光照下培养5～7 d，待幼苗长出后移栽到营养土中，2～3 d浇水1次.

1.2 拟南芥表型观察和旱后存活率的统计

选取生长3周的Col-0、glk1glk2、AhGLK1/glk1glk2拟南芥植株观察表型特征，统计各株系叶片数量，测量叶片的长度和宽度(n=10)，计算叶片长度与宽度比值、叶片长度与叶片总长度(叶片长度+叶柄长度)的比值.

选取生长14 d的Col-0、glk1glk2、AhGLK1/glk1glk2拟南芥植株土壤干旱10 d后再复水生长4 d，统计存活的植株数量. 根据公式：存活植株数/总植株数×100% 计算各株系的旱后存活率，实验重复3次.

1.3 叶片相对含水量的测定

取生长20 d拟南芥莲座叶(n=10)，称取鲜质量并记录. 转移至培养皿,放置烘箱中烘干，60 ℃处理72 h. 称取烘干后的叶片质量，按照公式：(鲜质量-干质量)/鲜质量×100%计算叶片的相对含水量.

1.4 气孔数量统计

取拟南芥莲座叶片(n=10)，透明胶撕下叶片下表皮，放入无水乙醇中固定10 min，置于载玻片上，体式显微镜(Nikon, Japan)下观察气孔，设置比例尺拍照，统计至少10个视野中的气孔数量，最后计算平均值.

1.5 叶绿素荧光参数测定

取生长20 d拟南芥植株(n=5)，避光处理30 min，采用便携式荧光测定仪(PAM-2100，Germany)测定第8位莲座叶的叶绿素荧光参数. 光强度200 μmol /(m2·s)下,先测定初始荧光F0和暗下最大荧光Fm，经光活化后，测定光下最大荧光Fm和稳态荧光Fs. 最大光化学效率Fv/Fm、有效光化学效率Yield、电子流速率ETR、非光化学淬灭系数NPQ和光化学淬灭系数qP均由仪器自动计算输出，实验重复3次，取平均值.

1.6 数据统计分析

采用SPSS22.0软件进行差异显著性分析，采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)对数据进行处理，结果以平均值±标准差表示，不同字母表示组别之间的差异具有统计学意义(P<0.05).

2 结果与分析

2.1 AhGLK1/glk1glk2拟南芥植株的表型特征

拟南芥glk1glk2表现出浅绿色叶片，并出现早抽薹，开花提前，白化长角果的表型，将GFP-GLK转入双突变体中能使以上表型得以恢复. 与野生型Col-0比较，glk1glk2突变体的叶绿素含量降低，叶绿素合成和光合作用相关基因的表达下调. 超表达GLK1或者GLK2导致叶绿素积累[5]. GLKs通过与叶绿素合成基因(如HEMA1、CHLH、CHLM、GUN4等)和光合作用相关基因(LHCB1.3、LHCB2.2、LHCB3、LHCB6、PsbQ等)的启动子直接结合，调控它们的表达，进而影响叶绿素合成和光合作用[8-10]. 本研究通过观察发现：与Col-0相比，glk1glk2植株叶片呈现浅绿色(图1)，而AhGLK1/glk1glk2植株叶片呈现绿色，与野生型叶色相同，说明AhGLK1可使glk1glk2突变体植株叶色恢复至正常的绿色，证实AhGLK1影响拟南芥叶片中叶绿素合成.AhGLK1/glk1glk2植株抽薹前的叶片总数量(16～20片)明显多于Col-0(10～12片)和glk1glk2突变体植株(10～12片)(图1).

图1Col-0、glk1glk2和AhGLK1/glk1glk2拟南芥株系叶色和抽薹前叶片数量

Figure 1 The colour and number of leaves inCol-0,glk1glk2andAhGLK1/glk1glk2lines

AhGLK1/glk1glk2生长至第3周时，叶片由两侧向内卷曲，叶片宽度/叶片长度比值明显低于Col-0和glk1glk2突变体植株(图2A、B)，第5～12叶位叶片的叶柄明显长于Col-0和glk1glk2突变体(图2C). 统计叶片长度与叶片总长度(叶片长度+叶柄长度)比值发现：该比值在AhGLK1/glk1glk2植株中明显低于Col-0和glk1glk2植株(图2D). 叶柄增长与叶片数量增加均有利于植物提高光合作用，使植株受到干旱胁迫时仍保持较好的生存能力. 而叶片卷曲有利于降低植物蒸腾速率，提高植株保水性[11]. 以上结果表明：AhGLK1影响拟南芥叶片数量和叶片形态发育，在干旱胁迫过程中，使植株具有更强的光合作用能力和较高含水量，进而避免受到严重损伤.

图2Col-0、glk1glk2和AhGLK1/glk1glk2拟南芥植株叶片表型

Figure 2 The leaf phenotypes ofCol-0,glk1glk2andAhGLK1/glk1glk2lines

注:图中不同字母表示差异具有统计学意义(P<0.05)，图4至图6同.

叶片衰老因子ORE1 (NAC092)通过与GLK1形成蛋白复合体而拮抗其功能，进而抑制GLK靶基因的表达，从而启动叶片衰老进程[12]. PIF4通过与GLK2启动子直接结合抑制其表达，阻碍叶绿体的发育，加速叶片衰老[13]，说明GLK在叶片衰老中发挥重要作用. 本文结果显示：AhGLK1/glk1glk2植株晚抽薹、晚开花，证实AhGLK1影响拟南芥植株的生长发育，延缓植株衰老(图3和表1)，但具体的分子机制有待进一步探讨.

图3Col-0、glk1glk2和AhGLK1/glk1glk2植株抽薹和开花情况

Figure 3 The bolting and flowering ofCol-0,glk1glk2andAhGLK1/glk1glk2lines

表1Col-0、glk1glk2和AhGLK1/glk1glk2植株抽薹和开花时间

Table1TheboltingandfloweringtimeofCol-0,glk1glk2andAhGLK1/glk1glk2lines

株系全部抽薹时间/d全部开花时间/dCol-020.13±1.25 b24.1±1.19 b glk1glk216.25±1.04 c 20.3±0.95 c AhGLK1/glk1glk230.25±1.28a 36.3±1.16 a

注:表中数据为平均值±标准差，同列数据后不同字母表示差异具有统计学意义(P<0.05).

2.2 AhGLK1对拟南芥叶绿体和气孔发育的影响

在拟南芥、水稻和番茄等作物中均发现GLK基因突变导致叶绿体生成减少，叶片中类囊体和叶绿体基粒严重减少[6]. 而过表达GLK增加叶绿体在光合组织和非光合组织中的生成，如水稻愈伤组织、拟南芥根[9-10]. 本研究中Col-0植株叶绿体呈现完整的、饱满的圆形，而glk1glk2突变体植株叶绿体形状各异，大部分呈现月牙状或椭圆形，形状不饱满，说明glk1glk2叶绿体发育不完善，与前人报道[6]一致. 而回复株系中，叶绿体形状基本与Col-0类似，大部分叶绿体为完整饱满状态. 统计发育异常叶绿体数量与总叶绿体数量的比值发现:glk1glk2突变体约47.6%，显著高于Col-0 (约4.8%)，而回复株系约为15.4%，高于Col-0，但显著低于glk1glk2(图4A、B)，说明AhGLK1对叶绿体发育有重要作用，能使glk1glk2突变体叶绿体发育异常的表型得以恢复.AhGLK1/glk1glk2株系叶片中气孔数显著增加，放大200倍时，视野中平均约29个气孔，而glk1glk2突变体叶片中气孔数量与Col-0接近，视野中约22个气孔(图4C)，说明AhGLK1促进拟南芥叶片中气孔数量增加.

2.3 AhGLK1对拟南芥抗旱能力的影响

分别对Col-0、glk1glk2和AhGLK1/glk1glk2拟南芥株系进行干旱处理10 d后再复水4 d，观察植株旱后存活情况，结果显示：双突变体植株存活的植株数量最少，明显低于Col-0植株，而AhGLK1/glk1glk2植株存活的植株数量与Col-0一致(图5A). 正常生长条件下，3个株系含水量的差异无统计学意义(图5B). 脱水干旱不同时间，双突变体植株(glk1glk2)的失水率明显高于野生型(Col-0)和回复株系(AhGLK1/glk1glk2)，回复株系与Col-0的失水率相比，差异无统计学意义(图5C). 说明双突变体植株的保水性较差，而回复株系的保水性与Col-0较一致，这与回复株系叶片卷曲的表型密切相关. 研究结果表明:AhGLK1可提高拟南芥植株叶片的保水性，避免在干旱时受到更大的损伤，提高植株的旱后存活率.

图4 Col-0、glk1glk2和AhGLK1/glk1glk2拟南芥植株的叶绿体和气孔发育

图5 Col-0、glk1glk2和AhGLK1/glk1glk2的旱后恢复情况及叶片相对含水量、失水率变化

Figure 5 The plant growth during recovery from drought, leaf relative water content and water loss rate ofCol-0,glk1glk2andAhGLK1/glk1glk2lines

2.4 干旱和复水条件下拟南芥的叶绿素荧光参数变化

植物光合作用对环境胁迫非常敏感，是衡量干旱胁迫损伤的重要指标之一. 植物受到干旱胁迫时，类囊体膜发生退化，早期叶片的衰老加速了光合色素的降解，光合作用速率急剧下降[14]. 此外，干旱胁迫会改变叶绿素a的荧光动力学，从而损害光合系统II (photosystem II, PSII)反应中心[15]. 环境胁迫对PSII和PSI的功能均产生不利影响，导致2个系统之间的电子传输减少[16]，并通过减少光合色素的水平，降低PSI和PSII吸收光能量的效率，从而导致植物光合能力降低[17]. 研究[18]表明：在短期和长期干旱条件下，拟南芥的叶绿素含量、叶绿素荧光和相对含水量逐渐降低.

本文结果显示：干旱胁迫下，3个株系叶片的Fv/Fm、ETR、Yield和qP均显著降低，光合作用能力都受到明显抑制. 而NPQ在glk1glk2突变体中无显著变化，但在Col-0和AhGLK1/glk1glk2株系中显著降低.Fv/Fm、ETR、Yield和qP在glk1glk2突变体的降低幅度均显著高于Col-0和AhGLK1/glk1glk2株系，说明glk1glk2突变体光合作用能力受到更为严重的损伤. 因此，在干旱时，glk1glk2突变体NPQ与正常对照组相比，差异无统计学意义，说明植株在干旱胁迫时光合作用能力降低，需要将多余能量以热能方式散发，以避免更严重的光损害.

在复水恢复生长后，Fv/Fm、ETR、Yield和qP均提高，但ETR、Yield和qP未能恢复至正常状态(图6). 结果表明:复水后，3个株系拟南芥的光合作用能力得以部分恢复；并且，干旱7 d对拟南芥光合系统的损伤较为严重，导致复水4 d后光合系统未能完全恢复. 而旱后恢复中，回复株系的ETR、Yield和qP均高于Col-0和glk1glk2株系，说明回复株系在恢复过程中具有更强的光合作用能力，从而使植株更好地恢复生长，这可能是回复株系叶片数量增加、叶柄增长所导致.

图6 Col-0、glk1glk2和AhGLK1/glk1glk2在干旱和复水恢复过程中叶绿素荧光参数的变化

Figure 6 The changes of chlorophyll fluorescence parameters inCol-0,glk1glk2andAhGLK1/glk1glk2lines during drought and recovery from drought

3 结论

GLK是定位于细胞核的转录激活子，属GARP家族成员，C末端包含高度保守GCT盒和Myb-like DNA结合结构域. 研究报道[19-23]：GLK负调节防御信号通路，参与生物胁迫过程，如禾谷镰刀菌、黄瓜花叶病毒和芜菁黄花叶病毒等. 在拟南芥中，GLK1与CCA1协同正调控谷氨酰胺合酶基因的表达，负调控谷氨酸脱氢酶基因和bZIP转录因子的表达，在有机氮积累过程中发挥重要作用[24]. 拟南芥GLK2通过调控钾离子通道相关基因的表达而影响气孔开闭，提高拟南芥对臭氧的耐受性，此过程不依赖ABA途径[25]. AtGLK通过调控WRKY40的表达而参与ABA响应过程，影响拟南芥抗旱能力[26]. 以上结果说明:GLK转录因子对植物生长发育、抵御逆境胁迫具有重要作用. 本文研究结果证实：AhGLK1影响拟南芥的叶绿素合成和叶绿体发育，与其他植物中GLKs功能相似. 除此之外，AhGLK1使拟南芥叶片数量增多，叶柄增长，叶片卷曲，气孔数量增加，光合作用能力提高，使植株受到干旱胁迫时仍保持较好的生存能力，并保持较高的含水量而避免受到干旱带来的严重损伤，进而提高拟南芥抗旱性和旱后恢复能力，但具体的分子机制还需进一步探讨. 另外，在拟南芥中，异源表达AhHDA1导致拟南芥抗旱性降低[27]，AhHDA1蛋白与AhGLK1蛋白互作，它们两者在抗旱中如何发挥作用也有待进一步研究.