茶树4-香豆酸辅酶A连接酶基因Cs4CL1的克隆与蛋白表达分析

高荣广　李昊　向勤锃　李敏

摘要：4-香豆酸辅酶A连接酶（4CL）是木质素合成过程中的关键酶。本试验以‘福鼎大白茶树为材料，克隆得到Cs4CL1基因，该基因长度为1 715 bp，开放阅读框长度1 623 bp，编码540个氨基酸。氨基酸同源性分析显示，Cs4CL1蛋白具有植物4CL酶的典型特征，即AMP结合功能域和GEICIRG保守区。系统进化分析显示，Cs4CL1蛋白与蓝果树、烟草、番茄等植物的4CL1蛋白聚为一类，属于4CL亚家族A。利用原核表达系统可诱导出具有活性的Cs4CL1重组蛋白，该蛋白大小为78 kD。本研究为深入解析Cs4CL1在茶树木质素合成途径中的功能奠定了基础。

关键词：茶树;木质素;Cs4CL1基因;Cs4CL1蛋白;同源性分析;原核表达分析

中图分类号：S571.103：Q78文献标识号：A文章编号：1001-4942（2020）03-0008-05

Abstract 4-Coumarate coenzyme A ligase （4CL） is the key enzyme in lignin biosynthesis. In this study， the 4-coumarate coenzyme A ligase gene Cs4CL1 was cloned from tea variety Fuding-Dabaicha. The length of Cs4CL1 was 1 715 bp including 1 623 bp open reading frame and encoding 540 amino acids. Amino acid sequence homology analysis showed that Cs4CL1 protein had typical characteristics of 4CL enzyme as AMP combined function domain and GEICIRG conserved region. Phylogenetic analysis showed that Cs4CL1 protein was clustered with 4CL1 proteins of Nyssa sinensis， Nicotiana tabacum， Solanum pennellii and other plants， belonging to 4CL subfamily A. Additionally， a 78 kD Cs4CL1 recombinant protein with high biological activity was induced in prokaryotic expression system. The results laid bases for further analyzing the function of Cs4CL1 gene in tea tree.

Keywords Tea tree; Lignin; Cs4CL1 gene; Cs4CL1 protein; Homology analysis; Prokaryotic expression analysis

嫩度是衡量茶葉品质的重要指标，幼嫩的鲜叶适制名优茶[1]。茶树新梢持嫩性与木质素含量负相关[2]。

木质素是植物体内的生物大分子，具有增强细胞壁硬度的重要生物学功能。它在植物体内的生物合成由苯丙氨酸解氨酶 （phenylalanine ammonia-lyase， PAL）、4-香豆酸辅酶A连接酶（4-coumarate coenzyme A ligase，4CL）、肉桂醇脱氢酶 （cinnamyl alcohol dehydrogenase， CAD） 等多个酶催化[3]。其中，4CL是合成途径的限速酶，其功能研究备受关注。目前，科研工作者已在拟南芥[4]、大豆[5]、茶树[6]、火炬松[7]、美洲山杨[8]、烟草[9]、水稻[10]、砀山酥梨[11]等植物中鉴定出4CL基因。根据遗传进化分析，不同植物的4CL基因分为亚家族A和亚家族B[12]。4CL亚家族A包括拟南芥的At4CL1和At4CL2基因，杂种杨的Ptd4CLl、Ptd4CL2和Pt4CLl基因;拟南芥At4CL3和杨树Pt4CL2归类为4CL亚家族B。研究发现，亚家族A的4CLs具有促进木质素生物合成的功能[13]， 当拟南芥4CL基因的表达被抑制后，体内木质素含量显著降低[14]。亚家族B主要参与类黄酮的生物合成[15]，茶树4CL是调节儿茶素合成的关键结构基因[6]。植物中的4CL存在多种同工酶，已相继从甜高粱、棉花、水稻中诱导出4CL蛋白[3，16，17]。

目前鲜有关于茶树持嫩性的研究，并且分析和衡量茶叶嫩度的方法不明确，致使相关研究进展缓慢。因此，本试验从‘福鼎大白茶树中克隆Cs4CL1基因，并进行Cs4CL1蛋白诱导，旨在为深入研究该基因的表达及其编码蛋白在茶树持嫩性中的功能提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用‘福鼎大白（Camellia sinensis cv. Fuding-Dabai Cha）茶树一芽二叶采自泰安市岱岳区茶溪谷，液氮速冻后置-80℃保存备用。1.2 总RNA提取和cDNA第一链合成使用OminiPlant RNA Kit（DNase Ⅰ）提取试剂盒（康为世纪产品）提取‘福鼎大白一芽二叶总RNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量和完整性。采用 TransScript-Uni One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反转录试剂盒（北京全式金生物技术有限公司产品）进行RNA反转录，合成的cDNA于-20℃保存备用。

1.3 Cs4CL1基因克隆

利用UltraEdit从茶树基因组中搜索4CL核苷酸序列，采用Primer Premier 5.0软件设计引物：Cs4CL1-F（5′-TTCCATAACAACCGAACAACATAT-3′）、Cs4CL1-R（5′-ATACGAGCAGCTACTCATGCT-3′）。以cDNA为模板扩增目的片段。PCR反應体系（20 μL）：模板1 μL，正反向引物各1 μL，Mix 10 μL，ddH2O 7 μL。PCR反应程序：98℃预变性30 s;98℃变性10 s，58℃退火30 s，72℃延伸100 s，35个循环;72℃后延伸5 min，16℃ 5 min。利用天根凝胶回收试剂盒回收PCR产物，并将回收的目的片段连入pMD18-T载体，经氨苄抗生素筛选后，挑选阳性克隆送青岛生工生物工程有限公司测序验证。1.4 Cs4CL1氨基酸同源性分析和系统发育树构建利用DNAMAN软件（version 5.2.2）进行Cs4CL1氨基酸多重序列比较和同源性分析。采用MegaX软件（version 10.0.5），构建4CL系统发育树，采用ClustalW多重比对、最大简约法（maximum parsimony， MP）和随机逐步比较方式。1.5 Cs4CL1蛋白的原核表达分析

将带有酶切位点的Cs4CL1基因连入原核表达载体pET32a（+），转入大肠杆菌BL21（DE3）;筛选阳性克隆，37℃活化菌体直至菌液OD值达到0.6～0.8，添加0.5 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷（IPTG），28℃诱导6 h;利用超声波破碎细胞，离心取上清，沉淀用8 mol/L尿素溶解，最后用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测蛋白。

2 结果与分析

2.1 Cs4CL1基因的克隆

本试验以反转录得到的cDNA为模板，经PCR扩增得到的条带如图1所示，片段长度约为1 700 bp。经测序分析可知，该基因全长1 715 bp，编码区序列长度1 623 bp，编码540个氨基酸。

2.2 Cs4CL1氨基酸同源性分析和系统进化树构建

Cs4CL蛋白具有植物4CL酶的典型特征，包含保守的AMP结合功能域（185～197氨基酸序列）和GEICIRG保守区（384～390氨基酸序列），见图2。采用DNAMAN软件预测该蛋白分子量约为55 kD。 BOXⅠ表示保守的AMP结合功能域，BOXⅡ表示GEICIRG保守区;甜椒 （Capsicum annuum），风铃辣椒 （Capsicum baccatum），黄灯笼椒 （Capsicum chinense），茶树 （Camellia sinensis），水曲柳 （Fraxinus mandshurica），野生烟草 （Nicotiana attenuata），蓝果树 （Nyssa sinensis），烟草 （Nicotiana tabacum），矮牵牛 （Petunia hybrida），潘那利番茄 （Solanum pennellii），马铃薯 （Solanum tuberosum），下同。

由图3可以看出，Cs4CL蛋白与蓝果树、烟草、番茄等植物的4CL1蛋白聚为一类，进化过程中与蓝果树、水曲柳的亲缘关系较近。因此，我们克隆的Cs4CL属于4CL亚家族A，并命名为Cs4CL1，其与‘舒茶早茶树的Cs4CL聚成一小类。

橡胶树（Hevea brasiliensis）;可可 （Theobroma cacao）;枸杞 （Lycium chinense）;垂枝桦 （Betula pendula）;芒果（Mangifera indica）;葡萄 （Vitis vinifera）;芝麻 （Sesamum indicum）;大豆 （Glycine max）;香橙（Citrus junos）。

2.3 Cs4CL1蛋白诱导及可溶性分析

Cs4CL1重组菌体诱导6 h后经超声破碎，分别取上清和沉淀，经 SDS-PAGE 检测，结果如图 4 所示，与0 h相比，诱导6 h后的Cs4CL1重组蛋白目的条带明显，上清和沉淀中均有明显的Cs4CL1重组蛋白条带。蛋白条带大小在75～80 kD 之间。

3 讨论与结论

木质素影响茶树组织细胞的机械强度和叶片韧性，量高会导致叶片老化、嫩度变差[1]，严重影响茶叶品质。木质素生物合成包括3条途径：一是苯丙烷代谢途径，二是木质素合成特异途径，三是木质素合成下游途径。4-香豆酸辅酶A连接酶是连接苯丙烷途径与木质素特异合成途径的关键酶[17，18]。拟南芥中反义表达4CL基因可使4CL酶活性明显下降，S-木质素含量下降[19]。烟草中异源表达毛白杨4CL基因的启动子，可显著提高茎木质部4CL基因表达量，使木质素含量比对照提高25%左右[20]。本试验以持嫩性较好的‘福鼎大白为研究对象，克隆了Cs4CL1基因，序列分析结果表明，Cs4CL1基因含有1 623 bp的开放阅读框，编码540个氨基酸。氨基酸同源序列分析结果表明，‘福鼎大白Cs4CL1与其它物种4CL蛋白氨基酸序列相似性较高，Cs4CL1具有4-香豆酸辅酶 A 连接酶的典型结构特征，即AMP结合功能域和GEICIRG保守区，表明在不同物种和不同类型4CL同工酶之间存在较高的序列上的保守性。

系统进化分析结果显示，Cs4CL1与不同植物中的4CL1同源性较高，同属为4CL亚家族A;Cs4CL1与‘舒茶早茶树的Cs4CL聚成一小类，二者可能是由同一祖先进化而来的分支。

蛋白原核表达分析结果表明，重组Cs4CL1蛋白条带长度约78 kD， His标签蛋白分子量约23 kD，因此Cs4CL1蛋白约为55 kD，这与预测的Cs4CL1蛋白分子量一致，说明Cs4CL1蛋白在大肠杆菌中成功表达;诱导后上清和沉淀中均有重组Cs4CL1蛋白的表达，表明我们获得了具有活性的Cs4CL1蛋白。本研究结果为后续深入研究Cs4CL1在茶树木质素合成过程中的作用奠定了基础，可为解析茶树持嫩性、改善茶叶品质提供理论依据。