灰葡萄孢Bctre1的基因组定位、蛋白质结构预测及表达分析

沈彦辉　陈宏坤　高璐阳　徐广飞　付强强

摘要：本研究选取灰葡萄孢菌株BC 05.10为试材，克隆Bctre1基因的核苷酸序列并对其进行生物信息学分析，同时采用荧光定量PCR法研究该基因在不同侵染时期、分生孢子萌发过程中以及不同碳源、海藻糖诱导下的表达情况。结果表明：该基因ID号为5428296，全长3 341 bp，位于scaffold_17负链的495 880～499 211位置，与核盘菌Sstre1的同源关系较近; BcTRE1蛋白由1 033个氨基酸残基编码组成，该蛋白N端具有2个6发卡结构的超糖苷酶家族和1个C端糖基水解酶家族63。荧光定量PCR结果显示，随着侵染时间的延长Bctre1表达量显著增加（P<0.05），48 h后表达量增加不显著;Bctre1在分生孢子萌发24 h时表达量最高;Bctre1在海藻糖为单一碳源的培养基中表达量最高，在海藻糖诱导下12 h 后Bctre1表达量显著增加（P<0.05）。综上，Bctre1与侵染寄主过程中分生孢子萌发及不同碳源利用密切相关，在侵染后期对促进菌丝生长发挥重要作用。

关键词：灰葡萄孢;Bctre1;基因组定位;蛋白结构;表达分析

中图分类号：S432.4+4：Q78文献标识号：A文章编号：1001-4942（2020）03-0013-06

Abstract In this study， the Botrytis cinerea  strain BC 05.10 was selected as test material， and the nucleotide sequence of Bctre1 gene were cloned and analyzed by bioinformatics method. The expression of Bctre1 gene at different infection stages， in the process of conidia germination， and under different carbon sources and trehalose induction were studied by fluorescence quantitative PCR method. The results showed that the gene ID number was 5428296， and its total length was 3 341 bp， which was located at 495 880～499 211 sites of the negative chain of scaffold_17. The homologous relationship between Bctre1 and Sstre1 was close. The protein encoded by Bctre1 gene contained 1 033 amino acid residues and had two 6-hairpin structure super glucosidase family and one C-terminal glycosyl hydrolase family 63. The results of fluorescence quantitative PCR showed that the expression of Bctre1 increased significantly with the increase of infection time （P<0.05）， while the increase of Bctre1 expression after 48 h was not significant. The expression of Bctre1 was the highest when conidia germinated for 24 h and the trehalose was used as the single carbon source in medium， and it increased significantly after 12 h under trehalose induction （P<0.05）.In summary， Bctre1 was closely related to conidia germination and different carbon source utilization during the process of infecting host， and played an important role in promoting mycelial growth at late stage of infection.

Keywords Botrytis cinerea; Bctre1; Genome location; Protein structure; Expression analysis

灰葡萄孢（Botrytis cinerea）侵染寄主廣泛，有遗传变异大、繁殖快、侵染性强等特点。它已对多种杀菌剂产生抗药性，但农业生产中为防止灰霉病的发生，大多采用加大杀菌剂使用量的方法，这对农产品的安全性造成了严重威胁[1，2]。海藻糖是一种普遍的储藏性糖类， 有研究表明，其参与真菌的生长发育、代谢反应、逆境胁迫、产孢和致病力等途径[3-6]。海藻糖酶（trehalase，Tre）能抑制海藻糖合成，当真菌体内的海藻糖含量降低时，其生长发育与致病性均受到影响。例如，海藻糖酶能抑制假丝酵母和稻瘟病菌在寄主体内的存活[3]。黑曲霉缺失treB基因可使分生孢子发育受限和致病力下降[7]。白色念珠菌缺失treB基因可导致致病力下降[4]。Foster等[8]研究结果表明，稻瘟病菌（Magnaprothe grisea）中编码中性海藻糖酶的基因NTH1突变会引起病菌在寄主组织内扩展能力下降，导致致病力下降。Doehlemann等[9]认为海藻糖酶基因不影响灰葡萄孢的致病力，但可以调控孢子的萌发率和影响孢子的热耐受能力，tre基因缺失突变体孢子萌发率下降[9]。

当前，昆虫、线虫和动物寄生线虫海藻糖酶基因的研究取得一系列进展，但关于植物病原真菌海藻糖酶基因的研究相对较少。本试验拟利用同源克隆技术获得Bctre1基因，采用软件对其结构特征进行分析，用实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）检测不同侵染时期、分生孢子萌发过程及不同碳源、海藻糖诱导下Bctre1的表达情况，旨在为研究灰葡萄孢Bctre1基因在其生长、发育及侵染过程的作用机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 灰葡萄孢（Botrytis cinerea）野生型菌株BC 05.10由养分资源高效开发与综合利用国家重点实验室保存。

1.1.2 供试培养基 PDA培养基：200 g马铃薯切碎加蒸馏水煮30 min后过滤，滤液加入20 g葡萄糖、15 g琼脂，加水定容至1 L。水琼脂培养基：琼脂12 g，加水定容至1 L。改良Fries培养基：蔗糖30 g、酒石酸胺5 g、NaCl 0.1 g、CaCl2 0.1 g、KH2PO4 1 g、NH4NO3 1 g、MgSO4 0.5 g、酵母浸膏0.5 g、琼脂12 g，加水定容至1 L。

1.2 主要试剂与仪器

RNA提取试剂盒（MiniBEST Universal RNA Extraction Kit）、反转录试剂盒（PrimeScriptTM RT Reagent Kit With gDNA Eraser）、Real-Time PCR试剂盒（SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ）均购于TaKaRa公司。凝胶成像系统，北京赛创科技有限公司产品;紫外分析仪，北京新技术应用研究所产品;DYCP-31DN型琼脂糖水平电泳仪，北京市六一仪器厂产品;TGL-16G型离心机，上海安亭科学仪器厂产品;SPX-250B-Z型生化培养箱，上海博迅实业有限公司产品;CFX96 Real-Time PCR Detection System，美国BIO-RAD公司产品）。

1.3 Bctre1的生物信息学分析用RNA提取试剂盒提取灰葡萄孢基因组的RNA，以反转录得到的cDNA为模板进行，利用Primer Premier 5.0软件设计Bctre1的扩增引物（Bctre1-F：5′-TCACATCTTCCATCTACGACGA-3′;Bctre1-R：5′-TCCATGAGACTTTACAAACCAGA-3′）。擴增体系 （25 μL）： cDNA模板2.0 μL，2.5 μmol/L dNTP  10.0 μL， 10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，5 U/μL Taq酶0.2 μL，10×PCR buffer 2.0 μL，ddH2O 9.8 μL。扩增程序： 95℃预变性5 min; 95℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min，循环35次;72℃终延伸 10 min。用1.0%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。

通过Blast搜索Botrytis cinerea基因组数据库（JGI，https：//genome.jgi.doe.gov/Botci1/Botci1.home.html），确定Bctre1在基因组中的精确位置。利用MEGA 4.0软件构建系统发育树。利用在线软件ProtParam（http：//www.expasy.org/tools/protparam.html）分析核酸及氨基酸序列、蛋白质理化性质。利用在线软件InterProScan（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/）对BcTRE1蛋白的功能域进行预测。分别利用SOMPA和Phyre 2软件分析和预测BcTRE1蛋白的二级结构和三维结构[10-13]。

1.4 灰葡萄孢病菌侵染过程中Bctre1的表达分析

将灰葡萄孢病菌BC 05.10接种于PDA平板上，23℃暗培养3 d。采用直径为1 cm的打孔器自PDA培养基上制取菌饼，保湿24～72 h后接种大豆叶片，并分别于接种后0、6、12、24、48、72 h剪取80～100 mg菌饼下方的大豆叶片，液氮速冻，-80℃保存备用。以18S rRNA作为内参基因，Real-Time PCR所用引物同1.3，均由上海生工生物工程有限公司合成。采用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit提取灰葡萄孢病菌不同侵染时期样品的RNA，采用PrimeScriptTM RT Reagent Kit With gDNA Eraser试剂盒进行cDNA的合成。美国伯乐公司CFX96荧光定量PCR仪，以不同侵染时期的cDNA为模板，用SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNaseH Plus）试剂盒进行Real-Time PCR扩增。扩增体系（25 μL）：2×SYBR Premix Ex TaqTM 12.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各1.0 μL，cDNA模板 2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。扩增程序：95℃ 30 s;95℃ 5 s;60℃ 30 s，40个循环;95℃ 5 s;60℃ 30 s。每个样品技术性重复4次，生物学重复3次。

1.5 灰葡萄孢病菌分生孢子萌发过程中Bctre1的表达分析

把玻璃纸置于水琼脂上，然后将灰葡萄孢菌株BC 05.10接种到该平板置于26℃暗培养，分别收集6、12、18、24 h的分生孢子，提取不同萌发时期分生孢子RNA，并进行cDNA的合成。检测不同阶段的表达规律，方法同1.4。

1.6 不同碳源培养下Bctre1的表达分析

将灰葡萄孢病菌菌株BC 05.10培养于改良的固体Fries培养基，分别将碳源换成1%的葡萄糖、海藻糖、蔗糖、果胶和甘油，26℃暗培养4 d，收集菌丝提取RNA，反转录成cDNA。Bctre1表达情况的检测方法同1.4。

1.7 海藻糖诱导下Bctre1的表达分析

将灰葡萄孢病菌菌株BC 05.10培养于改良的固体Fries培养基，将碳源换成1%的海藻糖，以不加碳源为对照，26℃暗培养4 d，收集菌丝提取RNA，反转录成cDNA。采用Real-Time PCR方法检测Bctre1表达情况，方法同1.4。

1.8 数据处理

采用Microsoft Excel 2003软件进行数据整理并作图，用SAS 8.1软件中Turkey法进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 Bctre1的生物信息学分析

2.1.1 Bctre1基因cDNA编码区的克隆 以反转录合成的 cDNA为模板，以Bctre1-F和Bctre1-R为引物，PCR扩增结果如图1所示，目的片段约为3 300 bp，与预期结果相符。胶回收目的片段测序后，可得Bctre1 cDNA长度为3 332 bp。

2.1.2 Bctre1在基因组中的定位 以前期扩增到的Bctre1基因序列为探针序列，利用Blastn搜索灰葡萄孢基因组数据库，得到基因ID号为5428296，基因全长3 341 bp，位于scaffold_17负链的495 880～499 211位置。

2.1.3 系统发育分析 利用MEGA 4.0软件对Bctre1與核盘菌、柄孢霉的tre1核苷酸序列进行系统发育分析，可知，Bctre1与核盘菌Sstre1同源关系较近（图2）。

2.1.4 理化性质分析 BcTRE1蛋白含有1 033个氨基酸残基，分子量为120 195.19，理论等电点5.48，预测该蛋白280 nm处的吸光度为2.035～2.031，不稳定系数为43.26，平均疏水性为-0.769。

2.1.5 保守功能域分析 BcTRE1蛋白序列在线分析结果表明，其N端有2个6发卡结构的超糖苷酶家族，分别位于398～674、723～902氨基酸残基位置。其中723～812氨基酸残基位置还有1个C端糖基水解酶家族63（图3）。

2.1.6 BcTRE1蛋白二级结构预测 BcTRE1蛋白的二级结构分析结果表明，该蛋白中无规则卷曲的含量为48.23%，由423个氨基酸残基构成;α-螺旋的含量为41.82%;β-折叠含量较少，占15.85%;β-转角含量最少，仅占8.32%（图4）。

2.2 Bctre1表达特性分析

2.2.1 不同侵染时期Bctre1的表达特性 由图5可以看出，一定范围（0～48 h）内，随着侵染时间的延长，Bctre1基因的表达量显著增加;72 h时，表达量虽有增加，但与48 h的相比未达显著水平。这可能是由于侵染48 h后，灰葡萄孢病菌体内的海藻糖酶含量达到临界点，产生的海藻糖酶用于清除体内多余的海藻糖造成的。

2.2.2 灰葡萄孢分生孢子生长过程中tre1基因的表达规律 Bctre1基因表达量随培养时间延长升高明显（图6），表明Bctre1基因的表达量与灰葡萄孢分生孢子生长呈正相关，推测Bctre1基因参与灰葡萄孢分生孢子萌发侵染过程。

2.2.3 不同碳源培养下Bctre1的表达分析 由图7可以看出，Bctre1基因表达量在以海藻糖为碳源的培养基中最高，约是以葡萄糖为碳源的培养基中表达量的2倍。这可能是Bctre1基因将海藻糖分解成两分子葡萄糖造成的，说明Bctre1基因促进海藻糖的分解， 葡萄糖与灰葡萄孢的生长发育有关。Bctre1基因在果胶培养基中的表达量与在葡萄糖培养基中的差异不显著（P>0.05），表明Bctre1在一定程度上能将果胶转化为灰葡萄孢可利用的糖源物质。甘油培养基中的Bctre1表达量最低，这可能是由于葡萄孢不能将甘油转化成其可利用的糖源物质的缘故。

2.2.4 海藻糖诱导下Bctre1基因的表达分析

[JP2]由图8可以看出，海藻糖诱导的Bctre1基因表达量高于未诱导，处理12 h后，差异达显著水平（P<0.05），[JP]24 h时表达量最高。结合2.2.1和2.2.2中Bctre1基因的表达规律，得出海藻糖可能与灰葡萄孢及其分生孢子的侵染有关。

3 讨论与结论

本研究通过PCR扩增得到Bctre1 基因，并运用生物信息学技术确定该基因位于灰葡萄孢基因组scaffold_17负链的495 880～499 211位置，全长为3 341 bp。通过核苷酸同源性分析发现，Bctre1与Sstre1同源关系较近。Bctre1的基因保守结构分析结果表明，该蛋白的N端有2个6发卡结构的超糖苷酶家族，分别位于398～674、723～902氨基酸残基位置，其中723～812氨基酸残基位置还有1个C端糖基水解酶家族63。

植物病原真菌中tre1的功能已有报道。Petitjean等[4]研究发现，白色念珠菌（Candida albicans）的tre基因与致病力有关，敲除tre基因后其致病力下降。Svanstrm等[7]研究发现，黑曲霉（Aspergillus niger）中treB基因与分生孢子的产生和海藻糖酶有关，treB突变菌株分生孢子梗只能产生少数有活力的分生孢子，而且不能降解分生孢子萌发过程中的胞内海藻糖。本研究发现， Bctre1在菌丝侵染后期和分生孢子生长后期表达量最大，表明tre1基因在灰葡萄孢侵染时发挥重要作用。本研究还发现，不同碳源培养基上Bctre1基因的表达量不同，其在海藻糖培养基中表达量是葡萄糖培养基中的2倍，因此，胁迫条件下灰葡萄孢利用tre1基因将海藻糖分解成葡萄糖，为其生长提供糖源。此外，海藻糖诱导情况下， Bctre1基因表达量显著增加，而此阶段的菌丝生长速率也较快，这可能与灰葡萄孢及其分生孢子的侵染有关。本试验初步证实了海藻糖酶与灰葡萄孢的菌丝和分子孢子生长发育的关系，证实Bctre1在灰葡萄孢侵染过程中发挥作用。但若要深入了解该基因的功能和机制，还需要从基因水平和蛋白质水平进行功能研究，探究其在灰葡萄孢生长、发育及侵染过程中的具体作用机制。

综上所述，Bctre1基因受灰葡萄孢生长发育和逆境胁迫因子诱导表达，推测其可能是调控灰葡萄孢侵染寄主及侵染后菌丝生长的关键基因。

参考文献：

[1] 童蕴慧，陈夕军，徐敬友，等.江苏省蔬菜灰葡萄孢生物学性状及致病力研究初报[J].中国蔬菜，2003，1（1）：33-34.

[2] 邱并生.灰葡萄孢分生孢子产生相关基因的功能分析[J].微生物学通报，2015， 42（3）：620.

[3] Tournu H， Fiori A， Van D P. Relevance of trehalose in pathogenicity： some general rules， yet many exceptions[J]. PLoS Pathogens， 2013，9（8）：e1003447.

[4] Petitjean M， Teste M A， Franois J M， et al. Yeast tolerance to various stresses relies on the trehalose-6P synthase （Tps1） protein， not on trehalose[J]. Journal of Biological Chemistry， 2015，290（26）：16177-16190.

[5] Ianutsevich E A， Danilova O A， Groza N V， et al. Heat shock response of thermophilic fungi： membrane lipids and soluble carbohydrates under elevated temperatures[J]. Microbiology， 2016，162（6）：989-999.

[6] John R， Raja V， Ahmad M， et al. Trehalose： metabolism and role in stress signaling in plants[J]. Stress Signaling in Plants： Genomics and Proteomics Perspective，2017， 2： 261-275.

[7] Svanstrm ， Melin P. Intracellular trehalase activity is requi-red for development， germination and heat-stress resistance of Aspergillus niger conidia[J]. Research in  Microbiology， 2013，164（2）：91-99.

[8] [JP2]Foster A J， Jenkinson J M， Talbot N J . Trehalose synthesis and metabolism are required at different stages of plant infection by Magnaporthe grisea[J].[JP]EMBO Journal，2003，22（2）：225-235.

[9] Doehlemann G， Berndt P， Hahn M. Trehalose metabolism is important for heat stress tolerance and germination of Botrytis cinerea[J]. Microbiology，2006，152（9）：2625-2634.

[10]劉微微， 郭丽婕， 贾慧，等. 玉米大斑病菌交配型基因克隆及生物信息学分析[J]. 华北农学报， 2014， 29（5）：10-15.

[11]杨峥， 申珅， 李贞杨，等. 玉米大斑病菌Velvet基因家族生物信息学分析[J]. 河北农业大学学报， 2016， 39（5）：18-25.

[12]孟川， 贾慧， 曹可可，等. 玉米大斑病菌漆酶基因的克隆与生物信息学分析[J]. 河北农业大学学报， 2013， 36（5）： 12-18.

[13]薛晓梦. 灰葡萄孢致病和菌核形成相关基因功能的初步研究[D]. 武汉：华中农业大学， 2016.