基于网络药理学的潜降汤治疗高血压作用机制研究Δ

白雅滢，刘殊羽，倪梦蔚，吴嘉瑞

(北京中医药大学中药学院，北京 100102)

高血压是心血管疾病最重要的危险因素，也是常见的慢性非传染性疾病，我国居民的死亡原因中，高血压所占比重很大[1]。目前，高血压的治疗方法普遍为药物治疗，但西药治疗多为单一用药，存在一定的局限性，在长期治疗中可能产生耐药性从而影响疗效[2]。潜降汤是国医大师颜正华先生治疗肝阴不足、肝阳上亢证的自拟方，在治疗高血压、眩晕等疾病上独有建树，其组方为：熟地黄、白芍合为君药，石决明、牡蛎共为臣药，茯苓、丹参、怀牛膝和益母草4味药为佐药，夜交藤、白菊花作为使药；诸药合用，达到滋阴平肝、潜阳安神的功效[3]。中医药治疗高血压肝阳上亢证，基于辨证施治的原则，从阴虚阳亢的基本病机出发，多使用平肝潜阳药(菊花、牡蛎)、滋阴药(白芍)、清热药(牡丹皮)和健脾药(茯苓)等，在潜阳、滋阴的基础上清热、健脾气，从而起到治疗效果[4]。中药方剂治疗是中医临床治疗的主要形式，具有“多组分、多靶点”的作用特点，讲求各单味中药在配伍下的共同作用[5]。本研究基于网络药理学方法，探究和预测潜降汤治疗高血压的作用机制，以期为中药方剂用于高血压的治疗提供思路和参考。

1 资料与方法

1.1 潜降汤药物化合物的检索

利用中药系统药理学数据库和分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，收集潜降汤方中熟地黄、白芍、茯苓、益母草、怀牛膝、丹参和白菊花(菊花)7味药物的活性化合物；补充查阅相关文献，寻找石决明、牡蛎和夜交藤的活性化合物。

1.2 对检索化合物的筛选

药物口服生物利用度(oral bioavailability，OB)是衡量药物体内药动学过程以及成药性的重要参数，表示药物的有效成分或活性被吸收进入血液循环，在活性位点起作用的速度和作用程度[6]。类药性(drug-likeness，DL)是预测化合物是否具备成为药物条件的指标[7]。本研究中，以OB≥35，DL≥0.18为阈值，筛选熟地黄、白芍、益母草、怀牛膝、茯苓和菊花的活性化合物；以OB≥50，DL≥0.18为阈值，筛选丹参活性化合物；同时，结合文献检索的石决明、牡蛎和夜交藤的活性化合物。

1.3 潜降汤“化合物-靶点”网络的构建

依托TCMSP、Supered数据库(http：//prediction.charite.de/index.php?site=chemdoodle_search_target)和Stitch数据库(http：//www.swisstargetprediction.ch/)，预测化合物的作用靶点，利用Cytoscape软件构建潜降汤的“化合物-靶点”网络图，探究潜降汤活性化合物和相关靶点的相互作用。

1.4 “潜降汤化合物-高血压交集靶点”蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络的构建

综合利用TCMSP数据库、治疗靶点数据库(therapeutic target database，TTD)(https：//db.idrblab.org/ttd/)，进行高血压疾病靶点的预测；在全球蛋白资源数据库UniProt(https：//www.uniprot.org/)中进行基因名转换，筛选出与化合物靶点相同的靶点；在String数据库(https：//string-db.org/cgi/input.pl)中对疾病和化合物的共有靶点进行PPI分析，利用Cytoscape构建网络图。

1.5 基因本体(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析

采用生物学信息注释数据库(the database for annotation，visualization and integrated discovery，DAVID)(https：//david.ncifcrf.gov/)平台，对PPI网络中的蛋白进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，以说明药物靶点蛋白在基因功能和信号通路中的作用。

1.6 整体研究过程

整体研究过程见图1。

图1 整体研究过程

2 结果

2.1 潜降汤方中活性化合物的筛选

收集到潜降汤方中中药活性化合物共887个，其中熟地黄76个，白芍85个，茯苓34个，丹参202个，益母草51个，怀牛膝76个，石决明和牡蛎共1个，夜交藤3个，白菊花(菊花)359个。根据筛选阈值和相关文献(石决明[8]、牡蛎[9]和夜交藤[10-11])，最终统计得到69个符合筛选条件的化合物，见表1。

2.2 潜降汤的“化合物-靶点”网络

潜降汤的69个活性化合物中，有48个化合物可得到预测靶点，合计580个。利用Cytoscape作图软件绘制潜降汤的“化合物-靶点”网络，见图2。图中，共包括628个节点(48个化合物节点，580个靶点节点)以及1 459条边；其中，圆形节点代表药物的活性化合物分子，菱形节点代表潜在靶点，每条边代表化合物和靶点的作用关系。在网络图中，度值表示与节点相连的边数，度值越大，与之相连接的化合物或靶点越多，越有可能是关键的化合物或者靶点。以度值大小作为排列依据，将度值≥4的预测靶点置于化合物所围成的圆圈中心，圆圈外的左侧为度值在2～<4范围内的预测靶点，右侧是度值为1的预测靶点。所得的“化合物-靶点”网络中，活性化合物分子的平均度值为30.4，其中，化合物“epidanshenspiroketall-actone”(Com63)所对应的潜在靶点数量最多，度值为122；其次为化合物“Przewaquinone B”(Com62)和化合物“Przewalskin B”(Com61)，度值均为100。基因TDP1的度值为25，是度值最高的潜在靶点；其次为基因AKR1B1，度值为18。

表1 潜降汤方中符合筛选条件的化合物

续表1

代码化合物名称OBDL来源Com59“2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-5-(3-hydroxypropyl)-7-methoxy-3-benzofurancarboxaldehyde”[2-(4-羟基-3-甲氧基苯基)-5-(3-羟丙基)-7-甲氧基-3-苯并呋喃甲醛]62.780.40丹参Com60“formyltanshinone”(甲酰基丹参酮)73.440.42丹参Com61“przewalskin b”(紫丹参萜醚b)110.320.44丹参Com62“Przewaquinone B”(紫丹参乙素)62.240.41丹参Com63“epidanshenspiroketallactone”(表丹参螺旋缩酮内脂)68.270.31丹参Com64“miltionone Ⅱ”(丹参醌新酮Ⅱ)71.030.44丹参Com65“prolithospermic acid”(原紫草酸)64.370.31丹参Com66“(2R)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-[(Z)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)acryloyl]oxy-propionic acid”{(2R)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-[(Z)-3-(3,4-二羟基苯基)丙烯酰基]氧基-丙酸}109.380.35丹参Com67“(Z)-3-[2-[(E)-2-(3,4-dihydroxyphenyl)vinyl]-3,4-dihydroxy-phenyl]acrylic acid”{(Z)-3- [2-[(E)-2-(3,4-二羟基苯基)乙烯基] -3,4-二羟基-苯基]丙烯酸}88.540.26丹参Com68“(6S)-6-hydroxy-1-methyl-6-methylol-8,9-dihydro-7H-naphtho[8,7-g]benzofuran-10,11-quinone”{(6S)-6-羟基-1-甲基-6-羟甲基-8,9-二氢-7H-萘[8,7-g]苯并呋喃-10,11-醌}75.390.46丹参Com69“(6S)-6-(hydroxymethyl)-1,6-dimethyl-8,9-dihydro-7H-naphtho[8,7-g]benzofuran-10,11-dione”{(6S)-6-(羟甲基)-1,6-二甲基-8,9-二氢-7H-萘[8,7-g]苯并呋喃-10,11-二酮}65.260.45丹参

注：“—”表示来自文献，无筛选阈值

Note：“—” represents the compound came from literature, no screening threshold

图2 潜降汤的“化合物-靶点”网络

2.3 疾病靶标筛选及与化合物靶标的关联

以“hypertension”(高血压)为疾病名搜索TTD数据库、TCMSP数据库，共得到相关靶点658个。对照由活性化合物所得的预测靶点，得到共有靶点60个。由于中药的方药治疗机制是一个复杂的调控网络，并不仅是直接的作用通路，在信号通路和靶点之间可能还存在一定程度的信号转换。于是，本研究利用String数据库将共有靶点进行PPI分析，以探究靶点之间直接与间接调控的作用关系，并绘制网络图，见图3。图中，共包含90个潜降汤化合物与高血压直接或间接的作用靶点，459条边。度值≥20的节点包括STAT1、FYN、JAK2、CXCR4、AGT、STAT3、CXCL12、VEGFA、SRC和AKT1；AKT1的度值最高，为37；SRC的度值为30；CXCL12和VEGFA的度值均为27。

图3 “潜降汤化合物-高血压交集靶点”的PPI网络

2.4 GO富集与KEGG通路富集分析

在得到潜降汤化合物和高血压交集靶点PPI网络的基础上，利用DAVID平台，对得到的90个蛋白进行GO功能和KEGG通路富集分析。根据假定值(P)<0.01且错误发现率(false discovery rate，FDR)<0.01为标准，筛选出22个GO条目并作图，见图4。图中，横坐标为各条目名称；柱状图对应左列纵坐标，代表条目数目；折线图对应右列纵坐标，为P的负对数。22个GO条目中，4个条目与细胞组成有关；5个条目与酶功能相关；2个条目与基因表达调控相关；6个条目与生理功能相关，包括调节平滑肌和血管的收缩；5个条目与信号传递有关，如Janus激酶/信号转导与转录激活子(Janus kinase-signal transducer and activator of transcription，JAK-STAT)级联。KEGG通路富集分析中，经过筛选后得到32条显著富集的通路，见图5。其中，富集基因数最多的通路为恶性肿瘤途径，共28个基因；趋化因子信号通路和乙型肝炎通路上富集的基因数分别为22和18个；富集程度最高的通路为肾细胞癌通路，其次为急性髓系白细胞通路，另外，催乳信号途径和慢性粒细胞白血病通路的富集程度也较高。

图4 GO条目分析

图5 KEGG通路富集分析

3 讨论

调查数据显示，近20年来，我国人群高血压患病率逐年升高，高血压与心血管疾病的发生呈独立、连续和直接的正相关关系，因此，如何有效治疗高血压仍是学者们不懈攻克的难题[12]。在高血压的治疗中，使用频率较高的抗高血压药包括血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素Ⅱ受体阻断剂、钙通道阻滞剂、利尿剂和β受体阻断剂[13]。目前，许多临床研究多使用单一药物治疗高血压；同时，大多数案例中对药物作用靶点尚不清楚，缺少联合用药的药动学及量效关系探究，患者在脱离抗高血压药的治疗后容易反复发作，临床治疗效果不理想[14]。中医药对高血压的认识有着独特的理论体系支撑，平肝潜阳法是临床治疗高血压肝阳上亢证的有效方法，可以显著降低患者的血压水平，并且可减少并发症的发生，提高患者生活质量。本研究所探究的方剂潜降汤在临床上治疗高血压肝阳上亢证，对患者的各项症状以及并发症均有很好的缓解效果。本研究应用网络药理学方法，探究潜降汤治疗高血压的作用机制，与中药方剂多组分、多靶点的特点相吻合的是，网络药理学注重从整体、系统和药物间相互作用的角度对药物进行剖析，是研究中药配伍及作用机制的新热点[15]。

本研究在收集潜降汤和高血压相关靶点的基础上，对潜降汤和高血压的交集靶点进行PPI映射并构建网络，对所得网络进行分析，得到度值排序居前5位的关键靶点为AKT1、SRC、CXCL12、VEGFA和STAT3。研究结果显示，在特发性肺动脉高压中，AKT1信号联级参与远端肺动脉平滑肌细胞的增殖和迁移增强，具有无效AKT1编码基因的小鼠患有肺动脉高压的概率很低，因此，认为AKT1活性降低在特发性肺动脉高压的治疗方面有着重要意义[16]。有学者指出，SRC激酶对原发性高血压大鼠模型中延髓头端腹外侧区投射的下丘脑室旁核神经元突触前和突触后部位上N-甲基-D-天冬氨酸受体活性的增强起到关键作用，认为SRC激酶是治疗神经源性高血压的潜在靶点[17]。度值排序居第3位的关键靶点CXCL12基因是影响冠心病的因素，研究结果表明，CXCL12基因会提高中国汉族人群的高血压患病风险，但其作用机制目前尚不明确[18]。VEGFA为血管内皮生长因子A，其在肿瘤血管生成中起着关键作用。肾小管上皮细胞中表达的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)可以刺激NO生成，靶向VEGF的药物与高血压的快速发展相关，其作用机制与NO的代谢有关[19]。STAT3基因与JAK2-STAT3通路有关，孟宪卿等[20]研究了刺蒺藜治疗肥胖型高血压的机制，发现刺蒺藜可以通过调控瘦素介导的JAK2-STAT3通路，改善瘦素抵抗，治疗肥胖型高血压；由此推测，STAT3在肥胖型高血压的治疗中起到重要作用。

对PPI网络中的靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析，结果显示，GO条目中，潜降汤治疗高血压的基因功能主要体现在蛋白质等大分子相互作用、细胞质膜构成和系统过程的信号调控等方面，包括质膜和质膜组成、JAK-STAT级联等。由于人体在高血压状态下细胞质膜钙泵功能低下，在基因表达水平下降以及高血压状态下，质膜可能发生一定的理化状态和性质变化，这可能与细胞质膜相关基因功能有关[21]。王俊岩等[22]在滋阴息风方对自发性高血压大鼠降压作用机制的研究中发现，其可改善高血压肾脏功能损伤，具体机制可能是通过抑制JAK-STAT信号通路的激活实现。KEGG通路涉及到的32个通路中包括趋化因子信号通路、恶性肿瘤信号通路、缺氧诱导因子1信号通路和催乳素信号通路等。趋化因子具有诱导白细胞聚集、黏附及游走的功能，与血管壁的炎症反应密切相关，可见趋化因子与其相应受体与高血压发病机制有关；作用于趋化因子的相关药物，能够抑制血管壁的炎症反应过程，可能成为临床上药物治疗高血压的新靶点[23]。催乳素裂解会产生催乳素片段(16 kD PRL)，可抑制心脏血管的功能，促进血管收缩，使炎症细胞黏附到内皮细胞，并促进心室腔扩大，导致高血压以及心功能不全的发生[24]。

综上所述，本研究认为潜降汤在高血压的治疗中起到关键作用的靶点有AKT1、SRC、CXCL12、VEGFA和STAT3等，与质膜组成、JAK-STAT级联、趋化因子信号通路和催乳素信号通路等有关，但其具体的作用机制尚待实验验证。本研究的结果初步验证了潜降汤对高血压的治疗作用和相关药理学机制，为进一步深入研究潜降汤的应用和治疗高血压的方法开阔了思路。