四水合七钼酸铵细菌内毒素检查方法研究

崔 黎 韩 峰（内蒙古自治区药品检验研究院呼和浩特010020）

四水合七钼酸铵为白色结晶性粉末，为混合微量元素注射液（10）的原料药之一。根据《中国药典》2015年版“化学药品注射剂安全性检查法指导原则”的要求，作为注射剂原料，应对其安全性指标作为内控标准进行考察。参照《中国药典》2015年版四部通则方法，对四水合七钼酸铵细菌内毒素限量检查的可行性进行了方法验证。

1 实验方法与结果

1.1 限值的确定：按照《中国药典》2015年版四部细菌内毒素检查法提供的公式L=K/M进行限值的确定。注射剂K=5 EU/kg·h。四水合七钼酸铵为混合微量元素注射液（10）的原料之一，混合微量元素注射液（10）的临床最大使用剂量为2瓶/人，每瓶中溶质约为100 mg（实际为95.2 mg），内毒素的限值：L=K/M=5 EU/KG/200 mg×60 kg=1.5 EU/mg。本着从严原则，拟定为：每1 mg四水合七钼酸铵含细菌内毒素的量应小于0.2 EU。

1.2 实验材料

1.2.1 仪器：细菌内毒素测定仪：型号BET-48G，天津天大天发科技有限公司；旋涡混合器：型号IKA MS3 DS25，广州仪科实验科技有限公司。

1.2.2 供试品：四水合七钼酸铵批号：20160301、20160302、20160303。

1.2.3 试剂

1.2.3.1 鲎试剂：生产单位：湛江安度斯生物有限公司

规格：0.1 mL，批号：1603142，灵敏度：0.03 EU/mL

规格：0.1 mL，批号：1512181，灵敏度：0.125 EU/mL

生产单位：湛江海洋生物有限公司

规格：0.1 mL，批号：1601043，灵敏度：0.03 EU/mL

规格：0.1 mL，批号：1601110，灵敏度：0.125 EU/mL

1.2.3.2 细菌内毒素工作标准品：生产单位：中国食品药品检定研究院，规格：80 EU/支，批号：150601—201478。

1.2.3.3 内毒素检查用水：生产单位：湛江安度斯生物有限公司，规格：5 mL/支，批号：1602160。

1.3 鲎试剂灵敏度复核试验：按照《中国药典》2015年版四部通则1143细菌内毒素检查法规定，进行鲎试剂灵敏度复核，结果见表1、表 2。

表1 鲎试剂灵敏度复核

结果：4批鲎试剂经用细菌内毒素工作标准品检查，λc为λ的0.5～2.0倍，结果均符合规定。

1.4 干扰实验预实验

1.4.1 最大有效稀释浓度（MVC）的计算：由公式MVC=λ/L

其中L为四水合七钼酸铵的细菌内毒素限值0.2 EU/mg，市售鲎试剂灵敏度λ范围在0.5 EU/mL～0.03 EU/mL。

则四水合七钼酸铵对应有效稀释浓度为：

MVC0.5=0.5 EU/ml÷0.2 EU/mg=2.50 mg/mL

MVC0.25=0.25 EU/ml÷0.2 EU/mg=1.25 mg/mL

MVC0.125=0.125 EU/ml÷0.2 EU/mg=0.62 mg/mL

MVC0.06=0.06 EU/ml÷0.2 EU/mg=0.30 mg/mL

MVC0.03=0.03 EU/ml÷0.2 EU/mg=0.15 mg/mL

1.4.2 实验操作：称取四水合七钼酸铵46.08 mg，加入内毒素检查用水2.3 mL充分溶解后，用内毒素检查用水分别稀释为2.50 mg/mL、1.25 mg/mL、0.62 mg/mL、0.30 mg/mL、0.15 mg/mL，即为NPC。

同时在上述系列溶液中加入细菌内毒素标准溶液，使试验液中均含有2 λ及0.25 λ浓度的细菌内毒素，记此系列溶液分别为PPC1和PPC2，每一浓度重复两管。

取两个不同厂家的鲎试剂，灵敏度为0.25 EU/mL，分别与上述PPC和NPC溶液进行反应，并设阳性和阴性对照。结果见表 2、表 3。

表2 四水合七钼酸铵干扰预试验（湛江安度斯生物有限公司，批号：1512181 λ=0.125EU/mL）

表3 四水合七钼酸铵干扰预试验（湛江海洋生物有限公司，批号：1601110 λ=0.125EU/mL）

由以上干扰预实验结果可以初步了解：两个厂家的鲎试剂对四水合七钼酸铵的细菌内毒素实验结果在0.15 mg/mL浓度及以下浓度时无干扰。

1.5 正式干扰实验：据预实验结果，将3批供试品用细菌内毒素检查用水稀释至终浓度为0.15 mg/mL的溶液，作为供试品阴性对照溶液，取内毒素工作标准品配成浓度为0.25，0.125，0.0625，0.03125 EU/mL的含供试品（浓度为0.15 mg/mL）溶液，同时做阴性对照和阳性对照。照《中国药典》2015年版四部通则1143中的干扰试验，结果见表4、表5。

表4 四水合七钼酸铵钴干扰试验（湛江安度斯生物有限公司，批号：1603142 λ=0.03EU/mL）

表5 四水合七钼酸铵干扰试验（湛江安度斯生物有限公司，批号：1601043 λ=0.03EU/mL）

表4、表 5 结果表明：ES在 0.5 λ～2 λ 之间，且 ET在 0.5 ES～2 ES范围内。说明0.15 mg/mL四水合七钼酸铵在此试验条件下，对鲎试剂与细菌内毒素工作标准品反应无干扰。因此可以确认四水合七钼酸铵对鲎试剂无干扰的最大浓度为0.15 mg/mL，使用标示灵敏度为0.03 EU/mL鲎试剂可对四水合七钼酸铵进行细菌内毒素检查。

1.6 样品细菌内毒素检查：按《中国药典》2015年版细菌内毒素检查法，取标示灵敏度为0.03 EU/mL的鲎试剂进行检查，用细菌内毒素检查用水（BET）将细菌内毒素标准品稀释成4 λ，2 λ（阳性对照溶液）浓度的溶液，再将3批样品用细菌内毒素检查用水（BET）制成供试品溶液，同时作供试品阳性对照、阳性和阴性对照。分别用不同企业鲎试剂进行试验，结果见表6、表7。

表6 四水合七钼酸铵细菌内毒素检查样品细菌内毒素检查结果（安度斯，批号：1603142）

表7 四水合七钼酸铵细菌内毒素检查样品细菌内毒素检查结果（海洋，批号：1601043）

表6、表7结果表明，使用上述两个厂家灵敏度为0.03 EU/mL的TAL对样品进行检验，结果符合规定。

2 结果与讨论

2.1 干扰预实验结果表明：四水合七钼酸铵在0.15 mg/mL及其以下浓度对鲎试剂凝集反应无增强或抑制作用。

2.2 正式干扰实验表明：0.15 mg/mL及其以下浓度对鲎试剂凝集反应无增强或抑制作用。分别考察不同企业生产的鲎试剂反应结果一致，ES/ET均在0.5～2.0之间，确定无干扰，说明本品可用标示灵敏度0.03 EU/mL鲎试剂进行细菌内毒素检查。

2.3 按照拟定的限值对三批四水合七钼酸铵进行了内毒素限量检查，结果均符合规定。

2.4 实验结论：根据以上试验，可以制定四水合七钼酸铵检查方法，取本品照（《中国药典》2015年版四部通则1143）检查，四水合七钼酸铵中含内毒素的量应小于0.2 EU/mg。