基于钴60的大鼠BMSCs细胞实验模型的建立

赵路 贾骏麒 田磊 靳丹 宗春琳 莫宏兵

放射治疗是参与了约70%的恶性肿瘤的治疗过程，其中约40%仅通过放疗即可达到根治目的[1]。放射线通过对人体组织细胞产生电离辐射效应从而实现对肿瘤的治疗作用，但由于放射线并不具有细胞和组织的特异性，故而常伴随着一系列并发症的发生，对患者的生存质量造成严重危害[2]。常用于放疗的射线类型主要包括放射性同位素所产生的α、β、γ射线、以及各类放疗机所产生的X射线等[3]。不同类型的射线因其能量、剂量率等不同，即使在相同的照射剂量下仍可对细胞和组织造成不同程度的电离辐射作用[4]。目前，放疗及其并发症研究的细胞实验模型主要是通过X射线加载实现的，本研究通过评估在不同剂量下基于钴60放射源发射的γ射线对SD大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)在增殖、凋亡以及相关细胞因子合成方面所造成的影响，寻找适用于放疗及其并发症研究的放射剂量，并与相同剂量及剂量率下X射线的电离辐射损伤能力进行比较，建立切实可行的基于γ射线的大鼠BMSCs细胞实验模型，为同类实验研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 细胞来源、分组及射线加载

BMSCs取自雄性幼年SD大鼠，将P3代细胞按照每孔2×103个细胞和2.5×106个细胞分别接种于96 孔板和6 cm培养皿中，在细胞贴壁后进行照射。将细胞分为空白对照组、γ射线组和X射线组，γ射线组根据放射加载剂量分为2、 4、 6、 8 Gy亚组(γ2～γ8)，X射线组根据放射加载剂量分为X2～X8亚组。

γ射线放射源采用西北核技术研究所的钴60放射源，通过调整培养皿与钴源之间的距离，将射线剂量率控制在2.538 Gy/min，对升降源过程中的边界效应进行积分计算，使细胞实际所受的累积剂量达到0、 2、 4、 6、 8 Gy。 X射线来源于陕核工业第二一五医院放疗科VARIAN CX5762型放疗机(瓦里安公司，美国)发射的高能X射线，剂量率为4 Gy/min，照射剂量与γ射线组保持一致。

1.2 电离辐射相关指标检测

对γ射线各亚组细胞分别在照射后1、 2、 3、 4、 5 d进行CCK-8染色检测细胞增殖能力并绘制生长曲线；在接受放射后第7 天使用倒置显微镜对实验组细胞形态进行观察、TUNEL染色观察细胞凋亡情况，并进行活/死细胞双染实验测定活细胞百分比，应用免疫荧光激光共聚焦技术检测还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶NOX家族亚型NOX4表达合成情况。

1.3 统计学分析

各组实验重复3 次，每次设置3 个复孔。用GraphPad Prism软件进行数据分析，student-t检验进行统计学分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 细胞形态改变

P3代细胞呈相互连接的梭形，γ射线照射后第7 天起，集落中部分细胞形态开始出现不规则化，其中4、 6、 8 Gy组细胞可以观察到碎裂细胞残骸明显增多(图 1)。

图1 γ射线照射后第7 天各亚组细胞形态变化 (倒置显微镜， ×40)

Fig 1 Cell morphology of the subgroups on the 7th day after γ - ray irradiation (Inverted microscopy, ×40)

2.2 细胞增殖力比较

在接受γ射线最初的72 h细胞增殖能力改变不明显，从第3 天起， 4、 6、 8 Gy组细胞增殖活变缓，但从第4 天开始出现下降出现明显下降(图 2)。

2.3 细胞凋亡率比较

γ射线造成细胞的凋亡随照射剂量增加而增多，γ2组少于γ4组(P<0.05)， γ6、γ8亚组之间无明显差异(P=0.23)(图 3)。

2.4 活细胞比例比较

随着照射剂量的增大， 2 种射线在大于2 Gy的照射剂量下均可造成活细胞比例的明显降低(P<0.05)，剂量相同条件下每亚组间活细胞比例无显著性差异(P=0.15)(图 4)。

2.5 NOX4合成水平比较

接受放射后2 组细胞均表现为NOX4合成水平的升高， 其中2 Gy组升高不明显， 4 Gy及以上放射剂量可导致NOX4合成水平显著增高(P<0.05)， 6 Gy和8 Gy组细胞实际的NOX4阳性表达细胞与4 Gy组相比并无明显增多。γ射线组和X射线组之间无显著差异(P=0.09)。

3 讨 论

肿瘤的放射治疗是利用放射线对肿瘤进行的一种局部治疗方法[5]，其射线包括放射性同位素产生的α、β、γ射线和各类X射线治疗机或加速器产生的X射线及各类粒子束等[6-7]。在各种类型的放疗射线来源中， 起主要作用的射线主要是X射线和γ射线， 二者均属电磁波，其区别在于：γ射线为放射性同位素原子核发生衰变过程中发出的核辐射，而X射线则是由高能电子撞击X线机球管导致原子核外电子能级升高，在向低能级跃迁过程中发射出的原子核外部辐射[7-8]。由于X射线波长远大于γ射线，故而后者的能量和在组织中的穿透性远大于前者。目前绝大多数研究射线对细胞生物学效应的实验模型都以X射线作为辐照加载条件， 但对于在临床治疗中仍大量应用的γ射线对生物体组织细胞造成的辐射损伤研究尚不充分。

图 2 接受γ射线照射后各亚组细胞生长曲线

放疗可以导致一系列并发症的发生，其中放射性颌骨骨髓炎(osteoradionecrosis of jaws, ORNJ)是头颈部恶性肿瘤放疗后最严重的一类并发症，发生率约8.2%～22%[9]，可导致放疗区内的口腔颌面部组织长期不愈、死骨暴露，张口受限、吞咽语言困难、病理性骨折和面部畸形等，使患者生活质量大大下降。ORNJ一旦发生，几乎无法逆转，目前尚无公认有效的预防和保守治疗方法，因此也成为了广大学者长期研究的课题。本课题组在前期研究中已经成功建立了基于电子直线加速器的ORNJ实验模型，且研究表明基于X线的放射可导致包括BMSCs、成纤维细胞等细胞发生增殖活性下降、细胞凋亡增多、局部氧化应激压力升高、肌成纤维细胞分化、细胞外基质纤维化等现象[10]。故而本实验选取细胞增殖能力、凋亡程度、NOX4合成表达量等几个具有代表性的现象作为评价指标。

图 3 接受γ射线照射后各亚组细胞TUNEL染色(TUNEL染色， ×100)

Fig 3 TUNEL staining of cells in the subgroups after γ- ray irradiation (TUNEL staining, ×100)

图 4 接受γ射线和X射线照射后各亚组细胞活细胞比例

Fig 4 The proportion of living cells in the subgroups after γ- ray irradiation

通过本实验研究发现，在2 Gy的低剂量照射条件下，细胞尽管在照射早期短暂发生了增殖能力减缓、凋亡水平升高等现象，但这种现象维持时间过短，细胞的增殖活性可以在照射后第3 天基本至空白对照组水平，且照射后1 周凋亡细胞所占比例与空白对照组基本无异。在4 Gy的中等照射剂量下，既可以确保明显的细胞增殖能力下降和细胞凋亡现象，又能保持相对较高比例的活细胞存量，可以为后续试验提供较为充足的细胞量；同时存在明显的促NOX4形成现象，与临床病理表现及前期动物实验结果贴合度较高。说明4 Gy射线确实对细胞造成了明确的电离辐射损伤，又不至于把大部分细胞杀死，可以为后续实验余留足够的细胞。而6、 8 Gy照射剂量虽然同样可造成细胞增殖能力和凋亡水平的明显改变，但其促NOX4合成能力较4 Gy未见明显差异，且活细胞比例相对较低，如应用于细胞模型的建立可能无法较好满足后续实验细胞数量的要求，故综合考虑选用4 Gy作为理想照射剂量。在不同类型射线电离辐射损伤作用差别方面，无论是细胞增殖、细胞凋亡、还是促NOX4形成能力方面，基于Co60加载的γ射线与基于放疗机加载的高能X射线均未观察到明显的组间差异，说明在仅就上述3 个指标而言X射线和γ射线在同等剂量率和剂量加载条件下其电离辐射损伤效果相当。

图 5 γ射线照射后各亚组细胞NOX4合成水平(CLSM, ×600)

Fig 5 The level of NOX4 synthesis in the subgroup after γ- ray irradiation (CLSM, ×600)

本实验通过在相同剂量率条件下对BMSCs加载梯度剂量的γ射线和X射线，基本明确了在选定剂量区间内细胞电离辐射损伤效应随剂量变化的趋势，筛选出2.538 Gy/min剂量率、 4 Gy剂量这一可较好应用于电离辐射损伤相关实验研究的理想参数。并且通过实验证明了在生物放射治疗领域的剂量条件下，相同剂量率和剂量的X射线与γ射线其电离辐射损伤效果没有显著差异，在放疗及其并发症研究领域二者可在该剂量区间实现等效替换。本实验所建立的γ射线细胞辐照模型可为研究放射性损伤提供一个新的细胞研究平台。