云岭牛无角性状的分子鉴定与应用

李 常， 王 宁， 刘玉香， 亐开兴， 张继才， 黄必志， 雷初朝

(1.陕西省佳县畜牧技术推广站，陕西 佳县 719200；2.云南省草地动物科学研究院，昆明 650212；3.西北农林科技大学动物科技学院，陕西 杨凌 712100)

牛角性状是由基因控制的，White等[1]通过研究发现牛无角对有角是显性。Medugorac等[2]通过对欧洲1 675头不同普通牛品种的有角与无角性状进行研究，发现202 bp片段的插入缺失(P202ID)导致欧洲普通牛表现为无角性状，该插入缺失位于1号染色体的IFNAR2和OLIG1基因之间，不改变编码序列或剪接位点。在荷斯坦牛中存在260 kb单倍型与其无角性状密切相关，该260 kb单倍型包含5个完全连锁的突变位点(P5ID、PG1654405A、PC1655463T、PC1768587A和P80kbID)。P5ID突变由12 bp序列(ttctcagaatag)更换为7 bp序列(cgcatca)，从而导致无角荷斯坦牛中该序列多了5 bp碱基序列；P80kbID表示80 kb重复序列位于纯合无角荷斯坦牛染色体的末端区域；还有3个SNPs分别位于第1 654 405(G→A)，1 655 463(C→T)和1 768 587(C→A)位。这5个突变位点为荷斯坦奶牛无角性状所特有。因此，携带1个或2个拷贝的P202ID等位基因的牛表现为无角，其基因型分别为Pp或者PP。牛有角性状由prs基因控制，无角性状由PC和PF基因控制。PF、PC、prs是3个复等位基因；而PF、PC是2个等显性复等位基因。PC和PF基因是根据无角牛起源的地区来命名的：起源于凯尔特地区的无角牛携带的单倍型P202ID用PC表示，而起源于荷斯坦地区的无角牛携带的5个完全连锁的突变位点用PF表示。因此，无角牛包括纯合无角PF/PF、PC/PC和PC/PF3种基因型，杂合无角PC/prs、PF/prs2种基因型，而有角牛只有prs/prs一种基因型。因此，理论上来讲，基于这6个无角突变位点就能鉴定该牛是无角牛还是有角牛。本研究旨在检测云岭牛种公牛和核心群母牛的有角与无角性状，所选云岭牛血统纯正，无荷斯坦奶牛血统。因此，通过PCR扩增方法对P202ID位点进行检测，理论上可以有效鉴定云岭牛的有角与无角性状及其相应的基因型，为云岭牛无角品系的选育提供分子遗传学证据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

试验自小哨示范牧场云岭牛核心育种场采集263头云岭牛(250头无角云岭牛、13头有角云岭牛)耳组织样本，-20 ℃保存。

1.2 基因组DNA提取及PCR扩增测序

利用酚—氯仿法提取基因组DNA。利用Medugorac等[2]和曾璐岚等[3]发表的P202ID引物进行PCR扩增。PCR体积为12.5 μL：2×Reaction Mix 6.25 μL，20 ng/μL DNA模板1.0 μL，上、下游引物(10 pmol/μL)各0.2 μL，去离子水4.85 μL。PCR扩增程序：95 ℃预变性5 min，34个循环(94 ℃变性40 s，59 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR产物用1%的琼脂糖电泳检测，在凝胶成像系统下观察并拍照，以此判断基因型。

2 结果与分析

用P202ID引物对263头云岭牛(250头无角云岭牛、13头有角云岭牛)的基因组DNA进行PCR扩增，扩增结果如图1所示；对扩增片段大小进行统计及基因型分析，云岭牛的有角与无角性状的分子鉴定结果如表1。由图1和表1可以看出，无角云岭牛又分为纯合无角牛和杂合无角牛。纯合无角云岭牛(公牛5头，母牛44头)的基因型为PC/PC，只有1条扩增带571 bp，其基因型频率为18.63%；杂合无角云岭牛(其中公牛9头，母牛158头)的基因型为PC/prs，有2条扩增带，分别为571 bp和369 bp，其基因型频率为63.50%，无角云岭牛总的基因型频率为82.13%。有角云岭牛(公牛1头，母牛4头)为隐性纯合子，其基因型为prs/prs，只有1条扩增带369 bp，其频率为1.90%。以上这221头云岭牛的基因型与云岭牛有角与无角性状完全一致，分子鉴定的成功率为84.03%。但是，本试验也检测到8头有角云岭牛(公牛2头，母牛6头)为杂合无角牛基因型(PC/prs)，其基因型频率为3.04%；34头无角云岭牛(母牛34头)为有角基因型(prs/prs)，其基因型频率为12.93%，总计有15.97%的分子鉴定结果与云岭牛已知的无角与有角性状不相符。

注：1，3，5，8，10，14泳道基因型为PC/prs；2，9，11，12泳道基因型为Prs/prs；4，6，13泳道基因型为PC/PC；7泳道为空白对照。

图1 云岭牛P202ID引物扩增的牛角性状多态性

表1 云岭牛单倍型P202ID的PCR扩增片段大小、基因型与基因型频率

3 讨 论

长期以来，牛的无角表型都是选择和研究的目标。随着肉牛业的快速发展，规模化养殖水平越来越高，在现代集约化饲养条件下，牛角不仅没有什么价值，还会对牛和人造成伤害。另外，牛长一对大角就需要消耗一定的营养物质，从而导致饲料转化率下降。因此，培育无角牛成了时代的需要，这样做既不违背去角引起的动物福利原则，又能提高肉牛的养殖效益。

在本试验中，221头云岭牛的基因型与其角的性状完全对应，成功率为84.03%，远低于夏南牛100%成功率[3]。还有15.97%云岭牛与已知的无角与有角性状不相符。原因有三点：第一，可能云岭牛无角与有角性状的记录有误，但错误率不会这么高；第二，可能与普通牛特殊的无角与有角性状的致因突变有关，例如，蒙古国牦牛的无角基因来自于无角蒙古牛起源，其无角突变为复杂的P219ID位点[4]；第三，可能与云岭牛含有瘤牛血统有关，因为云岭牛是由婆罗门牛、莫累灰牛和云南黄牛采用三元杂交选育而来，婆罗门牛属于瘤牛。牛无角与有角性状的致因突变都是在普通牛中鉴定出来的，瘤牛无角与有角的基因突变是否与普通牛一致，尚没有遗传学证据。尽管Koufariotis等[5]通过对4头无角和46头有角婆罗门牛的全基因组进行重测序分析，发现3头为纯合无角牛，1头为杂合无角婆罗门牛，其无角基因与凯尔特突变基因PC一致，为P202ID单倍型，但也不能排除瘤牛可能有独特的无角基因和突变位点。Chen等[6]通过对48头无角和16头有角蜀宣花牛的P202ID、P80kbID和P219ID变异进行基因分型，发现蜀宣花牛存在已知的3种候选突变(P202ID、P80kbID和P219ID)，而P202ID突变占主导地位。但是，他们的研究还发现1头无角蜀宣花牛没有携带这3种候选突变中的任何一种，提示还有别的突变影响牛的无角性状，表明决定牛有角与无角性状的基因突变可能有多个基因参与。因此，要完全弄清楚牛无角突变的分子机制，还需要更多的深入研究。

4 应 用

尽管本研究的分子鉴定技术用于鉴定云岭牛无角与有角性状的成功率为84.03%，但并不妨碍本研究的分子鉴定技术用于云岭牛无角品系的选育与应用。为了加快云岭牛无角品系的选育速度，最重要的是鉴定无角种公牛为纯合基因型PC/PC，其次，鉴定云岭无角牛核心母牛群也为纯合基因型PC/PC，再让纯合无角公牛PC/PC与纯合无角母牛PC/PC交配，那么后代全为无角牛。这样，只要有足够的纯合无角公牛与无角母牛，理论上经过一代这样的选种选配，其后代均为纯合无角公牛与母牛，无角牛品系的选育就完成了。因此，利用无角牛基因的分子鉴定技术，可以大大缩短无角牛品系的选育时间。尽管黄牛的世代间隔长，又是单胎动物，只要严格利用经过分子鉴定的纯合无角公牛与母牛进行选种选配，完全可以在5～10年内选育出云岭牛无角新品系。