山楂叶总黄酮通过调控miR-133b 改善缺氧复氧诱导的神经细胞损伤

李丽静 王领弟 吴晓光

（1.承德医学院附属医院药学部， 河北 承德067000； 2.河北省中药开发与研究重点实验室， 河北 承德067000）

缺氧缺血性脑损伤是临床常见的一大类中枢神经系统疾病，有较高的发病率和死亡率，其主要机制是脑缺血引起神经细胞凋亡，从而造成脑的相应区域的功能障碍［1］。寻找抑制缺氧缺血后神经细胞凋亡的有效药物，对改善缺血性脑损伤尤为重要。近年来，研究发现中药具有抗脑缺血再灌注后神经细胞凋亡的作用，探讨中药抑制神经细胞凋亡的作用机制具有重要意义［2］。山楂叶总黄酮是从山楂叶中提取的黄酮类化合物，在心、脑血管以及其他方面具有很好的药理作用［3］。有报道发现山楂叶总黄酮可抑制神经元凋亡，改善脑缺血再灌注损伤大鼠的神经功能［4］。山楂叶总黄酮还能通过上调Bcl-2／Bax 比值、下调caspase-3 表达抑制心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞凋亡［5］。有研究发现在缺氧复氧诱导的心肌细胞中miR-133b-5p 下调表达，上调其表达能抑制缺氧复氧诱导的细胞凋亡［6］。X-连锁的RNA 结合基序蛋白（RNA Binding Motif protein，X-Linked，RBMX） 位于人类X 染色体上，对大脑发育至关重要［7］。脊髓损伤后RBMX表达增加，且在脊髓损伤后神经元的凋亡、星形胶质细胞的增殖过程中发挥重要作用［8］。然而山楂叶总黄酮、miR-133b-5p 对缺氧复氧诱导的神经细胞损伤的影响及其机制尚不清楚，本实验旨在研究山楂叶总黄酮、miR-133b-5p 对缺氧复氧诱导的神经细胞损伤的影响及其机制是否与RBMX 有关。

1 材料

1.1 细胞株 人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y 购自中国科学院上海细胞库，于10% FBS 高糖DMEM培养基，37℃、5% CO2条件下培养细胞。

1.2 药物与试剂 山楂叶总黄酮购自西安斯诺特生物技术有限公司；胎牛血清（FBS，货号16000-044）、胰蛋白酶（货号25200-056）、DMEM 培养液（货号C11965500BT） 购自美国Gibco 公司；反转录试剂盒（货号RR037A）、实时荧光定量试剂盒（货号RR092C） 购自日本Takara 公司；Trizol试剂盒（货号15596026）、LipofectamineTM2000 转染试剂（货号11668-019） 购自美国Invitrogen 公司；二辛可宁酸（bicinchoninic acid，BCA） 试剂盒（货号23235）、二甲基亚砜（DMSO，货号D8418-50ML）、RIPA 蛋白裂解液（货 号YB20101ES60） 购自美国Sigma 公司；聚偏二氟乙烯膜（PVDF，货号044080） 购自美国Alfa 公司；十二烷基硫酸钠，钠盐-聚丙烯酰胺凝胶电泳（dodecyl sulfate，sodium salt-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）（货号P0012A） 购自北京碧云天生物科技有限公司；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC） 和碘化丙锭（PI） 试剂盒（货号CA1020）、LDH 试剂盒（货号BC0685）、SOD 试剂盒（货号BC0170）、MDA 试剂盒（货号BC0025） 购自北京索莱宝生物科技有限公司；兔抗人Bax 多克隆抗体（货号XYB343Hu01）、兔抗人Bcl-2 多克隆抗体（货号XYA778Mu01）、兔抗人GAPDH 多克隆抗体（货号xyKF703） 购自上海信裕生物科技有限公司；兔抗人RBMX 多克隆抗体（货号LS-C170358）、山羊抗兔IgG 辣根过氧化物酶（HRP，货号SE134） 购自上海恒斐生物科技有限公司；miR-NC、miR-133b、anti-miR-NC、anti-miR-133b、WT-RBMX 和MUT-RBMX 载体质粒购自金瑞斯生物科技公司。

1.3 仪器 CO2细胞培养箱购自美国Precision Scientific 公司；LightCycler480 荧光定量PCR 仪购自美国Roche 公司；Thermo FC 酶标仪购自美国Thermo 公司；FACS caliber 流式细胞仪、PowerPac蛋白电泳仪、Gel Doc XR＋凝胶显示系统购自美国BD 公司。

2 方法

2.1 H／R 模型建立 将神经细胞用无血清低糖的DMEM 培养基培养，置于持续充入95% N2、5%CO2的密闭缺氧培养箱中缺氧处理2 h，然后更换为含10% FBS 的高糖DMEM 培养基，37℃、5%CO2的无菌箱中继续培养6 h。

2.2 细胞转染及分组 山楂叶总黄酮低、中、高剂量（10、30、90 mg／L） 培 养SH-SY5Y 细 胞24 h，进 行H／R 处 理。将miR-NC、miR-133b、anti-miR-NC、anti-miR-133b 质粒转染至SH-SY5Y细胞中分别记为miR-NC组、miR-133b组、antimiR-NC组、anti-miR-133b组。miR-NC、miR-133b质粒转染至SH-SY5Y 细胞6 h，进行缺氧复氧处理，记为H／R＋miR-NC组、H／R＋miR-133b组。将anti-miR-NC、anti-miR-133b 转染至SH-SY5Y 细胞6 h，90 mg／L 山楂叶总黄酮处理24 h，再进行H／R 处理，记为山楂叶总黄酮＋anti-miR-NC组，山楂叶总黄酮＋anti-miR-133b组。

2.3 RT-PCR 检测细胞miR-133b、RBMXmRNA表达 正常组、模型组、山楂叶总黄酮（低、中、高剂量）组、H／R ＋miR-NC组、H／R ＋miR-133b组、山楂叶总黄酮＋anti-miR-NC组，山楂叶总黄酮＋anti-miR-133b组细胞继续培养48 h，提取各组细胞总RNA，将RNA 反转录为cDNA，依据荧光定量试剂盒说明，miR-133b、RBMX分别以U6 和GAPDH为内参进行PCR 扩增，循环条件为95℃、30 s，60℃、30 s；72℃、30 s，共40个循环；60℃延长5 min。每个样品重复3 次，采用2-△△ct法分析相对表达量。

2.4 Western blot 法检测RBMX、Bax、Bcl-2 蛋白表达 各组细胞继续培养48 h，加入RIPA 细胞裂解液于冰上裂解30 min；4℃、12 000g离心15 min，取上清。BCA 试剂盒测定蛋白样品浓度后进行SDS-PAGE，电泳结束后，将蛋白电转至PVDF 膜上，50 g／L 脱脂奶粉室温封闭1 h；分别加入兔抗人Bax 多克隆抗体、兔抗人Bcl-2 多克隆抗体、兔抗人RBMX 多克隆抗体、兔抗人GAPDH 多克隆抗体，4℃过夜；洗膜后，加入二抗山羊抗兔IgGHRP，室温孵育2 h；TBST 洗膜3 次，10 min／次。在暗室中曝光显影，再浸入定影，最后洗去残液晾干，将胶片用Quantity One 凝胶分析软件处理，测定各组蛋白条带的灰度值，以目的条带和GAPDH条带的比值作为蛋白表达，实验重复3 次。

2.5 检测LDH、SOD、MDA 水平 各组细胞继续培养48 h，取细胞培养上清液，按照LDH 试剂盒说明书检测细胞培养液中LDH 水平；细胞培养48 h后，去除培养基，用PBS 洗3 遍，细胞裂解、离心，取上清，按照试剂盒说明书进行操作检测细胞中SOD、MDA 水平，每组重复3 次。

2.6 流式细胞术检测细胞凋亡 各组细胞继续培养48 h，胰蛋白酶消化，4℃、300g离心10 min。预冷PBS 洗涤后重悬。按照Annexin V-FITC／PI 细胞凋亡检测试剂盒说明书，分别加入5 μL annexin V-FITC 和10 μL PI，轻轻混匀后室温避光孵育15 min，流式细胞仪检测激发波长488 nm 和发射波长530 nm 处的荧光强度，实验重复3 次。

2.7 荧光素酶报告基因实验检测miR-133b 对RBMX 的靶向调控 TargetScan 数据库显示RBMX 3′UTR 区域有miR-133b 结合位点。构建野生型和突变型基因靶点RBMX 的3′UTR 荧光素酶表达载体（WT-RBMX 和MUT-RBMX），取对数生长期SH-SY5Y 细胞接种于24 孔板（1×103／孔），待细胞生长至80%汇合时，用LipofectamineTM 2 000 分别将 WT-RBMX 和 MUT-RBMX 质 粒转染到SH-SY5Y，同时分别转染miR-133b 和miR-NC 质粒。依据说明书要求，使用荧光素酶报告基因检测仪进行双荧光素酶报告实验测定。实验结果以荧光素酶活性和Renilla 活性的比值进行统计学分析，实验重复3 次。

2.8 统计学分析 实验中每个样本均重复3 次，每次设3个复孔。使用SPSS 22.0 进行统计分析，数据以（） 表示，多组间比较采用单因素方差分析。以P≤0.05 为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 山楂叶总黄酮对H／R 诱导的神经细胞损伤的影响 与正常组相比，模型组LDH、MDA 水平升高，SOD 水平降低，Bcl-2 蛋白表达降低，Bax 蛋白表达升高，细胞凋亡率升高（P＜0.05）；与模型组相比，山楂叶总黄酮低、中、高剂量组LDH、MDA 水平降低，SOD 水平升高，Bcl-2 蛋白表达升高，Bax 蛋白表达降低，细胞凋亡率降低（P＜0.05），呈浓度依赖性，见表1、图1。山楂叶总黄酮可改善H／R 诱导的神经细胞损伤。

表1 山楂叶总黄酮对H／R 诱导的神经细胞损伤的影响（， n＝3）Tab.1 Effects of HLF on H／R-induced neuronal injury（， n＝3）

表1 山楂叶总黄酮对H／R 诱导的神经细胞损伤的影响（， n＝3）Tab.1 Effects of HLF on H／R-induced neuronal injury（， n＝3）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，＃P＜0.05；与山楂叶总黄酮低剂量组比较，＆P＜0.05；山楂叶总黄酮中剂量组比较，▲P＜0.05。

3.2 山楂叶总黄酮对H／R 诱导的神经细胞中miR-133b、RBMX 表达的影响 与正常组相比，模型组miR-133b 表达降低，RBMXmRNA 和蛋白表达升高（P＜0.05）；与模型组相比，山楂叶总黄酮低、中、高剂量组miR-133b 表达升高，RBMXmRNA和蛋白表达降低（P＜0.05），呈浓度依赖性，见图2、表2。山楂叶总黄酮抑制H／R 诱导的神经细胞中RBMX 表达，促进miR-133b 表达。

图1 山楂叶总黄酮对H／R 诱导的神经细胞凋亡的影响Fig.1 Effects of HLF on H／R-induced neuronal apoptosis

图2 Western blot 检测RBMX 蛋白表达Fig.2 Expression of RBMX protein by Western blot

3.3 miR-133b 靶向调控RBMX 的表达 通过TargetScan数据库预测到RBMX 与miR-133b 存在结合位点（图3A）。荧光素酶报告基因检测实验结果显示（表3），相较于miR-NC组，miR-133b组WT-RBMX 的神经细胞荧光素酶活性降低（P＜0.05）；而MUT-RBMX 的神经细胞荧光素酶活性差异无统计学意义。Western blot 检测结果显示（图3B、表4），相较于miR-NC组，miR-133b组RBMX 表达降低；而相较于anti-miR-NC组，antimiR-133b组RBMX 表达水平升高（P＜0.05）。miR-133b 靶向调控RBMX 的表达。

表2 山楂叶总黄酮对H／R 诱导的神经细胞中miR-133b和RBMX 表达的影响（， n＝3）Tab.2 Effects of HLF on expression of miR-133b and RBMX in H／R-induced neurons（， n＝3）

表2 山楂叶总黄酮对H／R 诱导的神经细胞中miR-133b和RBMX 表达的影响（， n＝3）Tab.2 Effects of HLF on expression of miR-133b and RBMX in H／R-induced neurons（， n＝3）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，＃P＜0.05；与山楂叶总黄酮低剂量组比较，＆P＜0.05；山楂叶总黄酮中剂量组比较，▲P＜0.05。

图3 miR-133b 靶向调控RBMX 的表达Fig.3 miR-133b target regulation on RBMX expression

表3 双荧光素酶报告实验（， n＝3）Tab.3 Dual luciferase reporter experiment（， n＝3）

表3 双荧光素酶报告实验（， n＝3）Tab.3 Dual luciferase reporter experiment（， n＝3）

注：与miR-NC组比较，*P＜0.05。

表4 miR-133b 调控RBMX 蛋白的表达（， n＝3）Tab.4 miR-133b regulation on the expression of RBMX protein（， n＝3）

表4 miR-133b 调控RBMX 蛋白的表达（， n＝3）Tab.4 miR-133b regulation on the expression of RBMX protein（， n＝3）

注：与miR-NC组比较，* P ＜0.05；与anti-miR-NC组比较，＃P＜0.05。

3.4 miR-133b 过表达对H／R 诱导的神经细胞损伤的影响 与正常组相比，模型组LDH、MDA 水平升高，SOD 水平降低，miR-133b、Bcl-2 表达降低，Bax 蛋白表达升高，细胞凋亡率升高（P＜0.05）；与H／R＋miR-NC组相比，H／R＋miR-133b组 LDH、MDA 水平降低，SOD 水平升高，miR-133b、Bcl-2 表达升高，Bax 蛋白表达降低，细胞凋亡率降 低（P＜0.05）（图4、表5）。miR-133b过表达保护H／R 诱导的神经细胞损伤。

图4 Western blot 检测凋亡相关蛋白的表达Fig.4 Expression of apoptosis-related proteins by Western blot

表5 miR-133b 过表达对H／R 诱导的神经细胞损伤的影响（， n＝3）Tab.5 Effect of miR-133b overexpression on H／R-induced neuronal injury（， n＝3）

表5 miR-133b 过表达对H／R 诱导的神经细胞损伤的影响（， n＝3）Tab.5 Effect of miR-133b overexpression on H／R-induced neuronal injury（， n＝3）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与H／R＋miR-NC组比较，＃P＜0.05。

3.5 抑制miR-133b 表达逆转了山楂叶总黄酮对H／R 诱导的神经细胞损伤的作用 与模型组相比，山楂叶总黄酮高剂量组LDH、MDA 水平降低，SOD 水平升高，miR-133b、Bcl-2 蛋白表达升高，RBMX、Bax 蛋白表达降低，细胞凋亡率降低（P＜0.05）；与山楂叶总黄酮＋anti-miR-NC组相比，山楂叶总黄酮＋anti-miR-133b组LDH、MDA 水平升高，SOD 水平降低，miR-133b、Bcl-2 表达降低，RBMX、Bax 蛋白表达升高，细胞凋亡率升高（P＜0.05），见表6、图5。抑制miR-133b 表达逆转了山楂叶总黄酮对H／R 诱导的神经细胞损伤的改善作用。

4 讨论

脑缺血再灌注会产生大量氧自由基和有毒活性氧，造成氧化应激反应从而导致细胞凋亡，而细胞凋亡可导致脑缺血性神经损伤，中药在预防和治疗缺血再灌注损伤和神经性疾病中扮演重要角色［9］。研究报道山楂叶总黄酮可降低缺氧再给氧后LDH、MDA 水平，提高SOD 水平从而增强细胞抗氧化作用，减少自由基及脂质过氧化物导致的细胞膜损伤，抑制缺氧再给氧损伤心肌细胞凋亡，从而改善心肌细胞缺氧再给氧损伤［10］。山楂叶总黄酮还能降低caspase-3 表达，改善H2O2诱导的乳鼠心肌细胞氧化应激和细胞凋亡［11］。此外，山楂叶总黄酮可提高脑组织中SOD 活性，降低MDA 及NO 含有量，从而减轻脑缺血再灌注神经细胞损伤［12］。本实验结果显示，山楂叶总黄酮可提高H／R 诱导的神经细胞中SOD 水平，降低LDH、MDA 水平，降低细胞凋亡率。说明，山楂叶总黄酮可保护H／R诱导的神经细胞损伤，其可能与提高细胞内的抗氧化能力有关。

表6 抑制miR-133b 表达逆转了山楂叶总黄酮对H／R 诱导的神经细胞损伤的作用（， n＝3）Tab.6 Inhibited miR-133b expression on reversing HLF effect to H／R-induced neuronal injury（， n＝3）

表6 抑制miR-133b 表达逆转了山楂叶总黄酮对H／R 诱导的神经细胞损伤的作用（， n＝3）Tab.6 Inhibited miR-133b expression on reversing HLF effect to H／R-induced neuronal injury（， n＝3）

注：与模型组比较，*P＜0.05；与山楂叶总黄酮＋anti-miR-NC组比较，＃P＜0.05。

图5 Western blot 检测RBMX 和凋亡相关蛋白表达Fig.5 RBMX and apoptosis-related protein expression by Western blot

据报道miRNA 参与缺血性脑卒中的氧化应激、细胞凋亡、再灌注损伤等病理生理过程，miRNA对早期干预治疗缺血性脑卒中有一定意义［13］。研究［14］发现上调miR-133b 能降低神经细胞凋亡，保护甲基苯丙胺诱导的神经损伤。过表达miR-133b可增加心肌细胞活力，降低LDH 活性及心肌细胞凋亡率，减轻心力衰竭大鼠心肌缺血再灌注损伤［15］。本实验结果显示，miR-133b 过表达也可提高H／R 诱导的神经细胞中SOD 水平，降低LDH、MDA 水平，降低细胞凋亡率。说明miR-133b 过表达能改善H／R 诱导的神经细胞损伤。还有研究报道吗啡预处理通过上调miR-133b-5p，进一步抑制靶基因Fas表达，从而减轻心肌细胞缺血再灌注缺氧再给氧损伤［16］。本实验结果显示，山楂叶总黄酮可提高miR-133b 的表达，而抑制miR-133b 表达逆转了山楂叶总黄酮对H／R 诱导的神经细胞损伤的保护作用。说明山楂叶总黄酮可能通过调控miR-133b 表达改善H／R 诱导的神经细胞损伤。

研究发现RBMX 与人乳腺癌促凋亡基因Bax正相关，可能参与细胞凋亡［17］。RBMX 是DNA 抵御外来损伤的重要因素，是一种肿瘤抑制因子［18-19］。光损伤后RBMX 在视网膜中的表达增加，RBMX 可能在视网膜光损伤后神经节细胞的凋亡过程中发挥重要作用［20］。本实验结果显示，山楂叶总黄酮可降低RBMX 的表达，且miR-133b 靶向调控RBMX 的表达。提示山楂叶总黄酮可能通过调控miR-133b，进而下调RBMX 的表达，改善H／R诱导的神经细胞损伤。

综上所述，山楂叶总黄酮及过表达miR-133b对缺氧复氧诱导的神经细胞损伤有保护作用，其机制可能与下调RBMX 表达及提高抗氧化能力有关。