金露梅在酪氨酸酶催化中的抑制机理

李晓雯 王春丽

（华东理工大学药学院， 制药工程与过程化学教育部工程研究中心， 上海市新药设计重点实验室， 上海200237）

酪氨酸酶即多酚氧化酶，常见于人体和动、植物体内，微生物中也能见到［1］，对黑色素代谢、儿茶酚胺有很大影响，能在一定程度上限制其代谢速度［2］。在酪氨酸酶单酚酶的刺激下，酪氨酸会发生羟化反应，生成邻位二羟基苯丙氨酸（L-多巴），而在二酚酶作用下后者会发生氧化反应，生成多巴醌，继续发生反应后就会形成黑色素［3］。因此，只要在酪氨酸酶发生反应的过程中抑制其活性，就可减少黑色素的形成，从而达到美白效果。

金露梅Potentilla fruticosaL.是蔷薇科委陵菜属灌木类植物［4］，为西藏常见药物，因其生长环境的温差较大、海拔较高、日照时间较长，其成分组成多样，活性极强［5］，包括黄酮类、三萜类、多糖类、鞣质、醌类等［6］。多酚作为一种广泛应用于美白产品的酪氨酸酶抑制剂，既可与底物竞争，结合酪氨酸酶，也可抑制酶反应活性，从而减少黑色素生成以达到美白祛斑的作用［7］。目前，对金露梅总多酚含有量及其抑制酪氨酸酶活性的报道较少［8］，故本实验考察该植物在酪氨酸酶催化中的抑制机理，以期为相关美白产品的研发提供科学根据。

1 材料

1.1 试剂与药物 金露梅采自西藏，经华东理工大学马磊副教授鉴定为正品。酪氨酸酶（美国Worthington 公司，1 080 U／mg）；L-多巴、L-酪氨酸对照品［阿拉丁试剂（上海） 有限公司］。无水乙醇、氢氧化钠、磷酸二氢钾均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。

1.2 仪器 JY5002 电子天平（上海复平仪器仪表有限公司）；WK-400B 高速药物粉碎机（山东精诚机械有限公司）；SHZ-3 循环水多用真空泵、HH-WO 电子恒温水浴锅（上海予华仪器有限公司）；PS-30AL 超声波清洗仪（深圳市洁康有限公司）；UV1900 紫外分光光度计（上海奥谱勒仪器有限公司）。

2 方法

2.1 总多酚制备与含有量测定

2.1.1 提取 称取金露梅全株5.0 g，粉碎处理后以30目筛进行筛选，置于锥形瓶中，加入100 mL 50%乙醇，50℃下超声提取30 min，得到粗提物，60℃下减压蒸馏除去乙醇，置于100 mL 量瓶中定容，即得金露梅总多酚提取物，质量浓度为50 g／L［9］。

2.1.2 分离纯化 采用HZ-828 大孔树脂，5 g／L 提取液以1.0 mL／min 体积流量上样50 mL，进行动态吸附，50 mL 70%乙醇进行动态洗脱，洗脱液减压蒸馏浓缩，即得纯化物［10］。

2.1.3 定量测定 采用福林酚测定法［11］。精密称取10 mg没食子酸对照品，离子水溶解并定容至100 mL，得0.1 mg／mL 溶 液，取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL于25 mL 量瓶中（终质量浓度分别为4、6、8、10、12、14、16 μg／mL），加入1 mL 福林酚试剂、2 mL 10%Na2CO3试剂，摇匀定容，25℃下反应1 h 后，测定其在最大吸收波长765 nm 波长处的吸光度（A765）。以溶液质量浓度为横坐标（X），吸光度为纵坐标（A） 进行回归，得到方程 为A＝0.131 3X-0.008 4（R2＝0.999 1），在0～16 μg／mL范围内线性关系良好。

将“2.1.2” 项下纯化物在60℃下通过减压蒸馏除去乙醇，去离子水定容至5 g／L，取1.0 mL，去离子水定容于10 mL 量瓶中，再量取0.5 mL 于25 mL 量瓶中，依次加入1 mL 福林酚试剂、2 mL 10% Na2CO3溶液，混匀，定容，2 5℃下反应1 h 后，测定A765。

结果，金露梅纯化后总多酚含有量为171.13 mg／g，终药液浓度为10 μg／mL。

2.2 酶活性测定 对酪氨酸酶活性进行检测的前提是多巴色素最大吸收峰在475 nm 波长处，而多巴色素来自于酪氨酸、L-多巴的酶催化氧化反应［12］。酪氨酸酶反应活性定义［13］为以每1 min 多巴色素在475 nm 波长处的吸光度（A475） 增加0.001，为1个酶活性单位，即1 U／min，可依据酶催化反应系统A475伴随时间的增长，得到对应的酶活性值。

2.2.1 单酚酶活性 参考文献［14］报道。以1.5 mmol／LL-酪氨酸为底物，在反应系统内依次加入3.1 mL 磷酸缓冲液（pH＝6.8）、1.5 mL 5.0 mmol／LL-酪氨酸（溶于pH ＝6.8 磷酸盐缓冲液中），在28℃恒温水浴锅中恒温10 min，依次加入0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 g／L 金露梅提取物各0.2 mL 及酪氨酸酶溶液0.2 mL，摇晃均匀后迅速置于紫外分光光度计中，在475 nm 波长处每30 s 读取1 次吸光度，连续15 min。在该反应体系中，酶终质量浓度为20 mg／L。

2.2.2 二酚酶活性 参考文献［15］报道。以1.0 mmol／LL-多巴为底物，在此反应体系内依次加入3.6 mL 磷酸缓冲液（pH＝6.8）、1.0 mL 5.0 mmol／LL-多巴（溶于pH ＝6.8磷酸盐缓冲液中），在28℃恒温水浴锅中恒温10 min，依次加入0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 g／L 金露梅提取物各0.2 mL 及酪氨酸酶溶液0.2 mL，摇晃均匀后迅速置于紫外分光光度计中，在475 nm 波长处每30 s 读取1 次吸光度，连续15 min。在该反应体系中，酶终质量浓度为4.0 mg／L。

2.2.3 计算方法 公式为相对酶活性＝［（A2-A1）／（A4-A3）］×100%，其中A1、A2分别为底物、酪氨酸酶与金露梅提取物溶液在一定时间段内（单酚酶活性5～10 min，二酚酶活性0～6 min） 对应的吸光度；A3、A4表示存在前2 种物质，但不存在金露梅提取物体系在1个时间间隔内的前后吸光度，时间段选择一致［16］。

2.3 金露梅对酪氨酸酶二酚酶活性抑制机理的分析 固定酪氨酸酶活性为66 U／mL，在反应体系内依次加入磷酸盐缓冲液（pH＝6.8）、L-多巴溶液、金露梅50%乙醇提取物各1 mL，置于水浴锅中，28℃下恒温10 min，再加入1 mL酪氨酸酶溶液，摇晃均匀迅速置于紫外分光光度计中进行检测。改 变L-多巴溶液浓度为0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol／L，测定0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 g／L 金露梅提取物A475，计算初速度V0，绘制浓度-初速度曲线。再利用Lineweaver-Burk 双倒数方程，由底物L-多巴溶液浓度、V0倒数为指标作图，测得米氏常数Km、酶促反应最大速率Vm，用来判断其抑制种类［17］。

以Lineweaver-Burk 双倒数方程直线斜率、截距为纵坐标，提取物溶液质量浓度为横坐标再绘图，得到对应的抑制常数KI、KIS［18］。V0-1＝Km·Vm-1（1＋CI·KI-1）CS-1＋Vm-1（1＋CI·KIS-1），其中V0为初速度，单位A／min；Km为米氏常数，单位mmol／L；Vm为最大反应速率，单位A／min；CI为金露梅提取物质量浓度，单位g／L；CS为底物浓度，单位mmol／L；KI为金露梅提取物与酶的反应常数，单位g／L；KIS为金露梅提取物和酶-底物络合物发生反应的常数，单位g／L［19］。

3 结果

3.1 金露梅提取物对酪氨酸酶单酚酶活性的影响 在单酚酶活性测定时使用酪氨酸酶，通常情况下能减缓其催化反应而出现迟滞时间，同时在反应系统中酶、底物浓度能影响延迟时间［20］。按“2.2” 项下方法测定A475，金露梅提取物对酪氨酸酶单酚酶作用的进程曲线见图1。由此可知，单酚酶活性存在迟滞时间（曲线的直线部分交于横坐标的值）［21］，在反应系统内提取物可让其活动延迟时间增加，而且质量浓度越高，延迟时间越长，曲线斜率减小，即稳态酶活性下降，表明它可在一定程度上抑制酪氨酸酶单酚酶的活性，缩减其效用。

金露梅提取物存在浓度差异时，会对酪氨酸酶催化氧化反应有影响，从而改变其L-酪氨酸的稳态酶活性（即5～10 min的相对酶活性）。图2 显示，随着提取物溶液质量浓度升高，稳态酶活性降低，IC50约为3.74 g／L。

图2 金露梅提取物对酪氨酸酶单酚酶稳态酶活性的影响

3.2 金露梅提取物对酪氨酸酶二酚酶活性的影响 按“2.2” 项下方法测定A475，结果见图3。由此可知，二酚酶催化氧化L-多巴过程中无时间延迟，随着提取物溶液质量浓度升高，曲线斜率明显增长，表明它可在一定程度上抑制二酚酶反应；在提取物溶液质量浓度相同的反应体系中，吸光度会随着时间延长而增大，但速率逐渐下降，表明二酚酶对氧化反应的催化速度变小。

图3 金露梅提取物对酪氨酸酶二酚酶作用的进程曲线

金露梅提取物质量浓度存在差异时，会给酪氨酸酶催化氧化反应造成影响，改变其L-多巴的稳态酶活性（即0～6 min 的相对酶活性）。图4 显示，随着提取物溶液质量浓度不断升高，稳态酶活性降低，IC50约为4.31 g／L。

图4 金露梅提取物对酪氨酸酶二酚酶稳态酶活性的影响

3.3 金露梅抑制酪氨酸酶二酚酶活性的机理 按“2.2”项下方法测定A475，计算初速度V0，绘制浓度-初速度曲线，结果见图5。由此可知，随着多巴溶液浓度升高，V0不断增长；金露梅提取物溶液质量浓度变化对酪氨酸酶二酚酶活性有不同程度的抑制作用，而且随着其质量浓度升高，与二酚酶的反应逐渐稳定，表明提取物会与底物竞争与酶结合，催化速率的下降是酶活性被抑制的后果，而不是因为酶丧失活性造成的。因此，可认为金露梅提取物对酪氨酸酶的作用为可逆性抑制［22］。

以底物L-多巴溶液质量浓度、V0倒数为指标，结合Lineweaver-Burk 双倒数方程进行拟合，结果见图6，对比酶催化反应的相应动力指数，通过表观米氏常数（Km）、最大反应速度（Vm） 来判断抑制类型［23］。由图6A 可知，双倒数图中的1组直线在第二象限内交叉于一点，Km、Vm都随提取物溶液质量浓度的升高而变化，Km增加，Vm值减少，表明提取物对酪氨酸酶的抑制机理为混合型效应，即它与酶在不断作用的过程中可同时与游离酶和酶-底物的络合物结合，从而发生非竞争性抑制反应，并且与L-多巴在相互竞争中和酪氨酸酶发生反应而形成竞争性抑制。

图5 金露梅提取物溶液质量浓度与其抑制作用的关系

根据Lineweaver-Burk 双倒数方程的斜率、纵截距，结合金露梅提取物溶液质量浓度来制图，用于判断结合度，结果见图6B、6C。由此可知，提取物对游离酶的抑制常数（KI）为3.76 g／L，而对酶-底物络合物的抑制常数（KIS） 为8.65 g／L，即它与游离酶的反应程度高于与酶-底物络合物的。

图6 金露梅提取物对酪氨酸酶催化氧化L-多巴抑制作用的Lineweaver-Burk 双倒数方程

4 结论

金露梅50%乙醇提取物经大孔树脂纯化后，总多酚含有量为171.13 mg／g，可在一定程度上抑制酪氨酸酶活性，并对单酚酶、二酚酶均存在显著的抑制作用，它抑制单酚酶反应迟滞时间的延长是主要表现，当后者活性降低到一半时其IC50约为3.74 g／L，而对二酚酶约为4.31 g／L。通过Lineweaver-Burk 双倒数图发现，提取物对二酚酶存在混合型抑制作用，对游离酶、及酶-底物络合物的抑制常数分别为3.76、8.65 g／L，表明它具有良好的美白活性，今后可对其主要有效成分及细胞生物学方面进行深入研究。