基于延胡索投料情况研究宫炎康颗粒质量现状

曹 欢 袁 杨 林 林 笔雪艳

（黑龙江省药品检验研究中心， 黑龙江 哈尔滨150088）

延胡索又名元胡，为罂粟科植物延胡索Corydalis yanhusuoW.T.Wang 的干燥块茎，能活血、行气、止痛，用于胸胁、脘腹疼痛等症。如今其市场需求量较大，逐渐出现不法商贩以次充好、以假冒真、牟取暴利等现象，其常见伪品有薯蓣珠牙、天南星等，经金胺O 染色加工后使用，对成药质量及消费者健康安全均有极大影响［1-5］。

宫炎康颗粒由当归、醋香附、川芎、海藻、赤芍、炮姜、红花、盐车前子、北败酱、泽兰、柴胡、延胡索12 味药材组成［6］，具有活血化瘀、解毒消肿的功效，临床上用于治疗慢性盆腔炎［7-8］，尚无不良反应报道。本品共2个规格，规格一每袋装9 g（无蔗糖），规格二每袋装9 g，对近20个生产企业的调研发现，方中延胡索均是粉碎后，原粉入药，其他药材则为提取后的挥发油及清膏入药。现有标准中，宫炎康颗粒及其他系列制剂的含有量测定指标大多为芍药苷［9-10］，很少涉及阿魏酸［11-12］，也尚无延胡索含有量控制的方法［13］。因此，本实验基于延胡索现状，以及宫炎康颗粒工艺特点、标准缺陷等因素，对方中该药材投料情况进行全面质量研究，以期为其相关标准的完善提供依据，保障人民用药安全。

1 材料

1.1 仪器 DM2500 Leica 荧光显微镜；Linomat5 半自动点样仪；Agilent 1100 液相色谱仪；Waters e2695 液相色谱仪；TW-20 水浴锅；SK2510LHC 超声仪。

1.2 试剂与药物 延胡索乙素（批号110736-201438，纯度99.9%）、金胺O（批号111770-200701） 对照品均购自中国食品药品检定研究院；宫炎康颗粒为国家评价抽验样品。乙腈、甲醇为色谱纯（美国霍尼韦尔公司）；磷酸为色谱纯（美国Sigma 公司）；二氯甲烷（上海试一化学试剂有限公司）；三乙胺（分析纯）、醋酸铵、氨水（氢氧化铵）、乙酸乙酯、甲酸均购自国药集团化学试剂有限公司。预制板硅胶G 板、进口MN 板。

2 方法与结果

2.1 异性有机物 取颗粒9 g，加50 mL 水超声30 min，放冷，滤过，滤渣中加入适量水合氯醛试液，装片，判定视野中不得检出除延胡索以外其他药材植物组织特征，见图1。

图1 植物组织特征

2.2 TLC 鉴别及金胺O 检查

2.2.1 TLC 鉴别（延胡索） 取颗粒（规格一） 约4.5 g或（规格二） 约9 g，研细，加5 mL 浓氨润湿，再加30 mL三氯甲烷超声处理40 min，滤过，滤液蒸干，残渣加1 mL甲醇溶解，作为供试品溶液；取缺药材阴性样品，同法制备阴性样品溶液；取对照药材0.5 g，同法制备对照药材溶液；取延胡索乙素对照品适量，加甲醇制成每1 mL 含0.5 mg该成分的对照品溶液。按照2015 年版《中国药典》四部通则0502（薄层色谱法），吸取上述溶液各5 μL，点于同一硅胶G 薄层板上，以正己烷-氯仿-甲醇（7.5∶4∶1） 为展开剂，展开，取出，晾干，置碘蒸气中熏至斑点清晰，紫外灯（365 nm） 下检视，结果见图2。由此可知，供试品色谱在与对照药材、对照品相应位置上显相同颜色的斑点。

图2 颗粒TLC 色谱图

2.2.2 金胺O 检查

2.2.2.1 TLC 法 取颗粒9 g，研细，加0.1%甲酸甲醇溶液50 mL，密塞，超声处理30 min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2 mL 溶解，作为供试品溶液；取金胺O 对照试剂适量，加甲醇制成每1 mL 含0.3 mg 该成分的溶液，作为对照试剂溶液。按照2015 年版《中国药典》 通则0502（薄层色谱法），取供试品溶液5 μL、对照试剂溶液2 μL，点于同一硅胶G 薄层板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-氨水（4∶5∶1∶1） 下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，日光下检视，结果见图3。按规定，供试品色谱在与对照试剂相应位置上不得显示相同颜色的斑点，若出现，则采用HPLC 法验证。

图3 颗粒金胺O 检查结果（预制板）

2.2.2.2 HPLC 法 按照2015 年版《中国药典》 0512（高效液相色谱法） 测定。

色谱条件与系统适应性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相甲醇（A） -0.05 mol／L 醋酸铵（B），梯度洗脱，程序见表1；检测波长为432 nm。理论塔板数按金胺O 对照试剂色谱中的主峰计算，应不低于2 000。

表1 梯度洗脱程序

对照试剂溶液制备：取金胺O 对照试剂适量，加甲醇制成每1 mL 含8 μg 该成分的溶液，即得。供试品溶液制备：取“2.2.2.1” 项下的供试品溶液，上清液用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

取对照试剂、供试品溶液各10 μL，在上述色谱条件下进样测定，结果见图4。按规定，供试品色谱在与金胺O对照试剂保留时间相应位置不得出现相同色谱峰，若出现，则采用二极管阵列检测器比较其在320～450 nm 波长范围的紫外-可见吸收光谱，而且应不相同。

图4 金胺O HPLC 色谱图

检测限：取金胺 O 对照试剂适 量，配制成1.566 μg／mL，在上述色谱条件下进样1 μL 测定，测得信噪比为12.7（主峰），仪器检出限（进样量×3／信噪比） 为0.37 ng，方法检出限［仪器检出限×样品稀释倍数／（样品取样量×样品进样体积）］为8.2 mg／kg；耐用性：采用Kromasil、Thermo C18、Ultimate LP-C18十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，取供试品、对照试剂溶液，上述色谱条件下进样测定，发现色谱峰分离度、理论塔板数均满足要求，耐用性良好。

2.3 含有量测定

2.3.1 色谱条件及系统适应性试验 Agilent TC-C18（2）色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈-0.1%磷酸（三乙胺调pH 值至6.0）（40∶60）；体积流量1.0 mL／min；柱温30℃；检测波长280 nm，理论塔板数按延胡索乙素峰计算应不低于3 000。精密取供试品溶液20 μL、对照试剂溶液10～20 μL，在上述色谱条件下进样测定，结果见图5。由此可知，供试品色谱图在与对照品相应位置上有相同保留时间的色谱峰，阴性无干扰。

2.3.2 对照品溶液制备 精密称取延胡索乙素对照品适量，甲醇制成每1 mL 含50 μg 该成分的溶液，即得。

图5 延胡索乙素HPLC 色谱图

2.3.3 供试品溶液制备 取颗粒（规格一） 约4.5 g 或（规格二） 约9 g，精密称定，置于锥形瓶中，精密加入浓氨试液-甲醇（1∶20） 混合溶液50 mL，称定质量，加热回流1 h，放冷，浓氨试液-甲醇（1∶20） 混合溶液补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25 mL，蒸至近干，50%甲醇溶解，转移至5 mL 量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3.4 线性关系考察 精密称取延胡索乙素对照品适量，加甲醇分别制成每 1 mL 含 1.163、5.814、11.628、29.071、116.284 μg 该成分的溶液，在“2.3.1” 项色谱条件下各进样20 μL 测定。以进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，得方程为Y＝18.119 5X＋3.561 2（r＝1.000 0），在23.26～2 325.68 ng 范围内线性关系良好。

2.3.5 精密度试验 取对照品溶液适量，在“2.3.1” 项色谱条件下进样测定5 次，测得延胡索乙素峰面积RSD 为0.1%，表明仪器精密度良好。

2.3.6 稳定性试验 取同一份供试品溶液（企业2，批号150326），于0、2、6、10、16 h 在“2.3.1” 项色谱条件下进样20 μL 测定，测得延胡索乙素含有量RSD 为1.8%，表明溶液在16 h 内稳定性良好。

2.3.7 重复性试验 取同一批颗粒6 份，按“2.3.3” 项下方法制备供试品溶液，在“2.3.1” 项色谱条件下进样测定，测得延胡索乙素含有量RSD 为2.9%，表明该方法重复性良好。

2.3.8 加样回收率试验 精密称取延胡索乙素含有量已知（0.051 mg／g） 的颗粒（企业2，批号150326） 9 份，每份约4.5 g，精密加入已知量对照品溶液，按“2.3.3” 项下方法制备供试品溶液，在 “2.3.1” 项色谱条件下进样20 μL测定，计算回收率，结果见表2。

2.3.9 耐用性试验 采用不同仪器（Agilent 1100、Waters e2695）、色谱柱［Agilent TC-C18（2）、WelchUltimate LP-C18、Kromasil 100-5C18］，取供试品、对照试剂溶 液，在“2.3.1” 项色谱条件下进样测定。结果，色谱峰分离度、理论塔板数均能满足要求，表明该方法耐用性良好。

表2 延胡索乙素加样回收率试验结果（n＝9）

2.3.10 样品含有量测定 精密吸取供试品溶液20 μL，在“2.3.1” 项色谱条件下进样测定，计算含有量，结果见表3。

表3 延胡索乙素含有量测定结果

3 讨论

本实验采用异性有机物检查法对7个企业宫炎康颗粒进行测定，发现企业4、6 检出草酸钙针晶，不属于方中任一药味，可能为延胡索常见伪品薯蓣珠牙，表明上述企业可能存在掺伪投料情况；采用TLC、HPLC 法，发现企业4检出金胺O 斑点及色谱峰，进一步印证了该现象。

现行标准及文献中有3 种延胡索鉴别方法，提取方法分别为（1） 浓氨湿润，氯仿提取；（2） 甲醇提取后溶液蒸干，残渣水溶调碱性后乙醚提取［14］；（3） 甲醇提取后溶液蒸干，残渣加5%醋酸溶解，调碱性后乙醚提取，发现方法（1） 操作简便，提取充分，延胡索药材及延胡索乙素荧光斑点较强，而展开方法分别为正己烷-氯仿-甲醇（7.5∶4∶1）、正己烷-氯仿-乙酸乙酯-丙酮（8∶1∶2∶1）、正己烷-乙酸乙酯-氨水（6∶4∶0.2），发现正己烷-氯仿-甲醇（7.5∶4∶1） 展开时，样品与对照药材对应荧光斑点更多，Rf值适宜，分离效果较好，阴性无干扰。

延胡索为原粉入药，占整个处方的6.7%。2015 年版《中国药典》 一部［15］规定，延胡索乙素含有量不低于0.050%，按该限度折算后宫炎康颗粒中其应不低于0.034 mg／g，结合实际生产可能由于粉碎、运输、加工等造成的损失，按50%转移率规定含有量限度为每1 g 含延胡索以延胡索乙素（C21H25NO4） 计不得少于0.017 mg，本实验发现10 批样品中其最低值0.001 mg／g，最高值0.085 mg／g，低于限度的共有4 批。由此可知，不同企业生产的宫炎康颗粒中延胡索质量存在较大差异，部分可能存在少投料情况。

综上所述，本实验检验结果均反映宫炎康颗粒中延胡索的质量，可全面控制其是否掺伪，定性定量控制其是否存在投料不实、药材质量差等情况，通过综合手段保证用药安全，也可为后续质量标准的建立奠定基础。