长足大竹象染色体核型分析

汪振宇，卫纪，廖鸿，杨瑶君，龙文聪

乐山师范学院生命科学学院，竹类病虫防控与资源开发四川省重点实验室，乐山 614000

长足大竹象（Cyrtotrachelus buquetiGuer）属鞘翅目象甲科，是目前竹林的最主要有害虫类之一，对丛生的竹林的危害率达到50%～90%[1]，2003年，长足大竹象已被列为我国林业危险性有害生物的一种。该虫主要分布在我国四川、广东、广西、贵州等地，国外主要分布泰国、缅甸、越南等东南亚国家[2-3]。在长足大竹象的探究方面，李涛、聂学文等研究了长足大竹象生物学特性及防治试验[2-3]，鞠瑞亭、玉鹏等分别研究报道了该虫的在四川地区、上海地区及广西地区的发生、危害及防治[4-5]，杨桦等一些学者研究了长足大竹象的繁殖行为和交配行为[6]，忙定泽等人提取和鉴定了长足大竹象成虫体表的信息化学物质[7]，蒲远凤等分析和评价了该虫的营养成分[8]，杨瑶君等研究了长足大竹象的前胸背板、鞘翅、触角的超微结构及对竹笋挥发物的触角电位反应，研究了该虫的生殖系统、呼吸系统的形态及超微结构，虫口密度与虫孔数、竹笋受害率的关系以及幼虫种群动态对气候的预测模型等[9-14]。尚未有长足大竹象染色体核型分析的研究报道，而染色体核型分析是遗传学、分子生物学、分类学等研究的基础。本研究以长足大竹象精巢为研究材料，研究了长足大竹象染色体的数目、形态等，并分析其核型特征，为期为长足大竹象的进一步研究提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试材料为长足大竹象成虫，采集自四川省乐山市沐川县大楠镇（经度104.00，纬度28.96），在实验室条件下进行人工饲养。室内饲养温度25℃、相对湿度75%、光周期12L∶12D，以新鲜竹笋进行饲养至性成熟期，每2d 更换1 次竹笋，待解剖用[10]。

1.2 染色体标本的制备

选取10 只性成熟期的长足大竹象雄虫制作标本，参照汪淑芳的方法[11]，挑取解剖出来的精巢，在盛有生理盐水的培养皿中除去其他组织，将取得的精巢置于EP 管中，在卡诺固定液（无水乙醇∶冰醋酸=3∶1）中固定过夜（8～12 h），挑出置于0.1 mol·L-1的醋酸洋红染液中染色10～15 min，取出置于清洁的载破片上，加一滴制成压片，用解剖针捣碎，盖上盖玻片，用镊子透轻敲盖玻片使材料分散如云雾状，然后用滤纸吸去多余的醋酸洋红，再进行压片，使组织进一步分散开。

1.3 观察与拍照

将制备好的染色体玻片在Olympus BX51 显微镜下观察，在40 倍物镜下选择染色体分散良好，形态清晰的分裂相终变期或中期进行染色体数目统计，然后转至100 倍油镜下进行显微照相。

1.4 染色体计数及核型分析

每个个体选取10 个以上形态清晰、分散适度、染色体数目完整的分裂相细胞进行显微拍照并计数[15]，选择拍摄的比较好的照片放大后测量染色体的臂长（Arm ratio），分析其相对长度（Relative length）实际长度（Physical length）、以及着丝粒指数（Centromeric index），染色体分类按照Levan、Kuo 提出的标准进行划分[16-17]，核型对称性分类按Stebbins 的标准进行划分[18]，数据处理、作图采用Excel 2003，染色体核型分析采用Adobe photoshop 7.0。性别决定机制是根据Dias 等通过性染色体的形态特征分析得出的方法[19]。根据染色体的长短进行编号。

2 结果与分析

2.1 染色体数目统计

通过显微镜观察，共选择出中期分裂相较好的细胞112 个，染色体计数统计结果见表1。结果表明，染色体数目低于等于18 条的细胞占总数的7.4%；染色体数目介于18 至22 条的细胞有21 个，占总数的10.7%；而染色体数目等于22 条的细胞73 个，占总数的65.2%；而高于22 条的细胞有18 个，所占比例为16.1%。由此可知，长足大竹象的染色体众数为22，核型为2n=22，染色体臂数NF=22。

表1 长足大竹象中期分裂相染色体计数统计Tab.1 Metaphase chromosome count statictics of Cyrtotrachelusbuqueti Guer

2.2 核型分析

采用Adobe photoshop 7.0 软件对长足大竹象处理并编号（见图1B）。长足大竹象核型分析数据见表2。可以看出，长足大竹象的染色体数目为2n=22，性别决定机制为Xyp型，都有着丝粒结构，此外，在试验中未观察到次级缢痕及随体的特征。其中16 条为中部着丝粒染色体（m），4 条为亚中部着丝粒染色体（sm），核型公式为：2n=22=16 m+4 sm+Xyp，X 染色体为中部着丝粒染色体，属于中长染色体，在整个染色体组中排第4 位，其相对长度为10.22±0.62 μm，Y 染色体呈圆点状，相对长度为3.93±0.08 μm，在整个染色体中最小（图1 箭头所示）。1 号染色体相对长度最长，为17.92±0.27 μm，是一对中部着丝粒染色体。染色体中最长与最短染色体比大于4∶1，臂比大于2∶1 的染色体百分比为0.1，故长足大竹象的染色体核型为2C 型。

图1 长足大竹象中期分裂相染色体（A）及染色体核型（B）图谱Fig.1 Chromosome (A) and karyotype (B) of metaphase of Cyrtotrachelus buqueti Guer

表2 长足大竹象核型指数Tab.2 Karyotype index of Cyrtotrachelus buqueti Guer

2.3 四分体时期染色体

长足大竹象细胞在减数第一次分裂的四分体时期，显微镜明场和荧光观察可以清晰的看到11 对同源染色体正在联会（见图2：A、B、C、D），同时在联会时，同源染色体表现为明显的“8”“0”“X”等形状（见图2E、F）。

图2 长足大竹象精母细胞中期核型Fig.2 Chromosome kyrotype of spermatospore in mitotic metaphase of Cyrtotrachelus buqueti Guer

2.4 多倍体细胞

在实验材料的筛选过程中发现一些多倍体（见图3），特别是幼虫的组织，其中成虫精巢组织中也有相应数量的多倍体细胞，可能是脂肪体细胞，脂肪体细胞是昆虫的营养物质贮存的主要器官，也是中间代谢的主要组织，与生长、变态和生殖等生理机能密切相关[20]。

图3 长足大竹象脂肪体细胞Fig.3 Fat body cell of Cyrtotrachelus buqueti Guer

3 结论与讨论

昆虫染色体压片制备的选择很重要，不同种类的昆虫其染色体压片材料的制备方法也不尽相同。很多人在制备染色体标本时选用神经节、胚胎等组织匀浆后离心处理[21-22]，由于精巢（卵巢）相比其他组织而言，更容易匀浆，而繁殖期雌虫体内存在大量的受精卵，使解剖卵巢存在很大难度。因此，根据前期预实验对实验材料的筛选，选择成虫的精巢作为最佳的实验材料。

通过对长足大竹象染色体的制片、镜检、数据统计分析得出：长足大竹象染色体数目2n=22，其中常染色体10 对，性染色体1 对，均为中部/亚中部着丝粒染色体，NF=22；性别决定机制为Xyp 型，核型公式为：2n=22=16 m+4 sm+Xyp；最长染色体与最短染色体比大于4∶1，臂比大于2∶1 的染色体百分比为0.1，故长足大竹象的染色体核型为2C 型，未观察到次级缢痕及随体的特征。这一结果与Alexandra A 等人在2015年对四个地区的玉米象的核型分析是一致的[23]，但试验中发现有少数细胞的染色体多于或少于2n=22，可能是在制片过程中少数染色体丢失或者染色体分散不好造成的，由于除此之外，在某些细胞中发现一些非正倍体，（1～2 个较小的染色体）(见图1)，推断这可能是B 染色体，B 染色体的存在会对A 染色体的形态和行为产生影响，对特定基因的表达具备积极意义，同时B 染色体数量会影响生物个体的生长、发育等。Silva 等研究了不同地区玉米象的核型分析，并发现不同地区的玉米象中B 染色体的数目不同[23]。B 染色体数目的差异在一定程度上会影响种群密度的变化，在不同的地区，B 染色体的数量不定。这一观点Moraes 研究一致[24]。但不同物种的染色体的组成，着丝粒的位置以及染色体的形态结构存在一定差别。由于本试验的实验材料没有相应的比对库，所以不能对其进行荧光显带技术处理。

本研究发现长足大竹象具有大量的多倍体细胞，这一现象与七星瓢虫成虫脂肪体细胞核具有多倍性一致[25]，同时也与白蚁脂肪体核有多倍体相应证[26]。脂肪体能储存蛋白质、糖类和脂肪等养分，供形成成虫出土之前的休眠中、蛹期和成虫期的需求，因此，幼虫以及蛹含有丰富的脂肪体与长足大竹象的生活史中11 个月生活在地下有大的关系。

长足大竹象的细胞在减数第一次分裂的四分体期间，同源染色体间的联会，其形态表现为“0”、“8”、“X”等形状。这一结论与甜菜夜蛾细胞分裂期染色体的形态结构以及蝗虫减数分裂时期的染色体形态结构是一致的[27-28]。同源染色体形成环状、端部交叉、尾尾对的构型（见图2E、F）。染色体交叉频率越高，说明在减数分裂过程中，姐妹染色体及姐妹染色单体的互换频率越高，染色体行为越复杂，越活跃，反之染色体越稳定[28]。这一细胞生物学现象对研究生物的遗传多样性以及进化具有十分重要的作用。