UPLC-MS/MS法测定饲料级兽药中甲硝唑和地美硝唑的含量

田海娇，张府君，武 婷

(1 山西省分析科学研究院，山西 太原 030006；2 山西药科职业学院中药系，山西 太原 030031)

甲硝唑和地美硝唑作为硝基咪唑类药物具有抗原虫和抗厌氧菌活性[1]，主要用于预防、治疗滴虫、原虫病和厌氧菌引起的感染[2]。很多养殖户对该类药物的毒副作用了解不充分,常在动物饲养中造成药剂量偏高，但同时也带来了药物残留问题[3]，间接危害人体健康。体内外毒理试验证实，硝基咪唑类药物具有致畸[4]、致突变[5]、致癌[6]作用。我国农业部2002年235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》中明确规定甲硝唑和地美硝唑允许用作治疗用，但不得在动物性食品中检出[7]。欧盟在96/23/EC欧盟理事会指令及EC2377/90[8]中将甲硝唑和地美硝唑列入A类禁用药。因此，对饲料级兽药中这类物质的含量监测显得尤为重要。

硝基咪唑类药物化学性质不稳定，易分解，因此对这类物质的检测比较困难。目前检测方法主要有气相色谱法[9]、气相色谱-质谱法[10]、液相色谱法[11]以及液相色谱-串联质谱法[12]。气相法和气质法的缺点是需要衍生化，液相法的选择性和灵敏度较差。本实验采用超高效液相色谱-串联质谱法同时检测饲料级兽药中的甲硝唑和地美硝咪唑，该方法具有快速高效、高灵敏度等特点，为从源头上对饲料级兽药的监控提供技术支持。

1 实 验

1.1 仪器与试剂

超高效液相色谱串联四极杆质谱仪(ACQUITY Ultra Performance LCTM)，美国Waters公司；涡旋混合器(TALBOYS Advanced Vortex Mixer)，上海安谱实验科技股份有限公司；AL104电子分析天平，德国Mettler-Toledo公司；Ultra turrax IKA T18超声波，德国IKA公司。

乙腈、甲醇、甲酸(色谱纯)，美国Fisher公司；超纯水(电阻率为18.2 MΩ*cm)。甲硝唑、地美硝唑标准品(纯度为95%)，国家生物制品所。分别准确称取甲硝唑和地美硝唑标准品10.0 mg，用甲醇溶解并准确定容到10 mL配制成浓度为1000 μg/mL的标准储备液，并置于在-4 ℃冰箱中保存备用。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理

本实验通过对多种提取方法进行对比后发现采用超声萃取法，操作简单，高效。准确称取2.0 g样品，加入4 mL 无水乙醇后超声10 min后，用0.22 μm滤膜过滤至进样瓶，待上机分析。

1.2.2 色谱条件

色谱柱为BEH C18柱(50 mm×2.1 mm,1.8 μm)；柱温为35 ℃；进样量为10 μL；流动相为乙腈和0.1%甲酸水溶液，流速0.3 mL/min；采用梯度洗脱程序：0 min→ 3 min，10%A→90%A；3 min→ 3.1 min，90%A→ 10%A；3.1 min→ 4 min，10%A。

1.2.3 质谱条件

采用电喷雾电离(ESI)正离子扫描；离子源温度为120 ℃；脱溶剂气温度为350 ℃；脱溶剂气流采用氮气(流速700 L/hr)；锥孔气流采用氮气(流速50 L/hr)；毛细管电压3.0 kV；碰撞气为氩气，碰撞气压3.50×10-4MPa；检测方式为多反应监测(MRM)。MRM条件见表1。

表1 离子对、锥孔电压、碰撞能量

2 结 果

2.1 线性范围

根据样品溶液中这两种物质的含量，选定峰高相近的标准工作溶液。用甲醇将混标储备溶液稀释至浓度分别为0.00、0.05、0.10、0.20、0.50 mg/L进行测定，以峰面积为Y轴与对相应的浓度为X轴绘制标准曲线，得出相关系数均大于0.9980，表明甲硝唑和地美硝唑溶液的浓度与对应的峰面积呈现良好的线性关系。以信噪比(S/N)≥10计算，甲硝唑和地美硝唑两种物质的定量限均为0.1 mg/kg。

2.2 回收率与精密度

参考标准SN/T0001中对于禁用物质或未设定容许限的物质进行回收率试验一般选择LOQ、2LOQ、10LOQ作为添加浓度水平的规定，以及本试验检测样品中甲硝唑和地美硝唑的含量较低，故采用空白样品基质进行浓度水平为0.2、0.5、1.0 mg/L的添加回收试验，测得甲硝唑和地美硝唑在三个添加水平下的的回收率(±RSD)分别为88.6%±5.1%，91.4%±8.0%，95.4%±3.6%和89.3%±7.4%，90.9%±5.8%，95.8%±5.7%。

3 讨 论

3.1 流动相的选择

流动相是影响待测物质分离效果和保留时间的重要因素。《进口兽药质量标准》1999年版中是选用基础溶剂组合甲醇-水作为流动相，结果色谱峰拖尾严重，分离度及柱效较低。鉴于地美硝唑具有弱碱性，考虑在流动相中使用偏酸性的缓冲液，这样可以改善峰形，防止拖尾，分离效果较好[15]。由于乙腈对目标物溶解性较高[3]，因此本方法采用了乙腈-1%甲酸水溶液作为流动相。

3.2 仪器条件的优化

在正离子模式下，选择甲硝唑和地美硝唑的最佳分子离子峰以及其锥孔电压，然后再对一对碎片进行选择及碰撞能量进行优化得出优化后仪器条件下的色谱图。图1为甲硝唑和地美硝唑标准品色谱图。

图1 甲硝唑(a)和地美硝唑(b)0.1 mg/kg多反应监测(MRM)标准色谱图

4 结 论

采用超高效液相色谱串联质谱仪技术手段建立了测定饲料级兽药制剂中甲硝唑和地美硝唑的最优检测方法，该法具有检测限低、回收率高、简单快速等优点，减少时间和材料的能耗，为检测甲硝唑和地美硝唑的含量提供了有效的技术支持和帮助。