大熊猫源枝孢样枝孢霉侵染小鼠皮肤的病理学过程

刘真，刘璐，马晓平*，姜尧章，王承东，古玉

(1.四川农业大学动物医学院，四川 成都 611130；2.动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川 成都 611130；3.中国大熊猫保护研究中心，四川 都江堰 611800；4.四川农业大学生命科学院，四川 雅安 625014)

MA 等[4-5]在大熊猫皮肤病患处和生殖道内均发现枝孢样枝孢霉，经接种感染小鼠致病性试验后发现，枝孢样枝孢霉对正常家兔和免疫抑制家兔均可致病，对家兔皮肤有较强的致病性，能引起家兔皮肤形成红斑结节，且损伤随着时间的推移有加重的趋势，有可能是由红斑结节逐渐发展为溃疡并形成肉芽肿等，却未对该菌的具体侵染过程进行深入研究。同年，马晓平等[6]又研究了各培养环境因子对枝孢样枝孢霉生长的影响，得出了枝孢样枝孢霉的最适生长环境。桑红等[2]的研究结果表明，枝孢样枝孢霉对小鼠皮肤有较强机会致病性。GU 等[7]利用差减抑制杂交技术研究了枝孢样枝孢霉的分子致病机理，发现枝孢样枝孢霉α/β 水解酶基因在强弱毒株的表达显著上调或下调，是最有可能的致病基因。迄今尚少见对该菌的具体侵染过程的详细报道。笔者研究枝孢样枝孢霉对动物体的具体侵染过程，旨在对进一步诊断、治疗、预防该菌所致暗色丝孢霉病提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌种

分离自大熊猫皮肤病患处的枝孢样枝孢霉[3]，由四川农业大学动物医学院临床兽医学实验室保存。

1.1.2 供试动物

180 只健康小鼠6～8 周龄，体质量(20±5) g，雌、雄各半。

1.2 方法

1.2.1 菌悬液的配制

将保存菌株转种于PDA 培养基斜面，25 ℃培养1 周，用0.1 moL/L PBS 液(含0.1%吐温-80)冲洗斜面，将冲洗液置于离心管中，3 000 r/min 离心5 min，弃上清液，重复3 次[8]。最后用0.9%NaCl 溶液稀释沉淀物，用血细胞计数器计数，配成1×106cfu/mL 的菌悬液，菌丝与孢子的比例低于1∶10。

INCI中文名称：抗坏血酸（维生素C），英文名称：Ascorbic acid，CAS号：50-81-7，英文名：Vitamin C，是一种水溶性维生素，水果和蔬菜中含量丰富。分子式：C6H8O6，分子量：176.13，外观：无色晶体，熔点：190～192 ℃，沸点：（无），紫外吸收最大值：245 nm，比旋度：+20.5°～+21.5°，呈酸性，具有较强的还原性，加热或在溶液中易氧化分解，在碱性条件下更易被氧化，为己糖衍生物。

1.2.2 试验动物分组和处理

将供试的180 只小鼠随机分为2 组，每组90只。①试验组，腹腔两侧对称选2 个点皮下注射，接种0.4 mL 致病菌悬液。②对照组，不接种致病菌，于相同部位注射等量0.9%NaCl 溶液。接种部位均用苦味酸作标记。每日固定时间点处死试验组和对照组小鼠各3 只，取接种部位剖检，并用4%福尔马林液固定，以备病理学检查。

1.2.3 剖解及病理学观察

小鼠接种菌后，于12 h(第1 天)观察体况和接种部位发病情况，并同时取3 只小鼠以颈椎脱臼法处死剖检，观察接种处及周围皮肤[9]，钳取接种处皮肤组织块，用4%福尔马林液固定，再进行脱水透明、浸蜡、包埋、切片、脱蜡、HE 染色[10]、PAS银染、封固等步骤[11]，切片完成后在光学显微镜下进行病理组织学观察及拍照[12]。之后每隔24 h 按上述步骤同样处理和观察。根据病理切片观察结果，确定小鼠连续3 d 感染情况稳定的时期，为观察结束期。

1.2.4 统计分析

对病理切片拍照后，随机选取每天处死小鼠皮肤组织病理切片的30 个同等面积不同视野的圆形区域，运用Image-Pro Plus 6.0 统计每个区域内免疫细胞数、孢子数和菌丝数，并对30 个区域的总数取平均数进行分析。

1.2.5 组织逆培养并鉴定

在超净工作台内，将剖检后所取组织样品浸在75%乙醇中表面除菌，然后用灭菌蒸馏水清洗2 次，用无菌组织剪剪碎组织，然后分点接种到PDA 培养基上。每个样本接种3 个培养皿，25 ℃培养1～2 周，挑取长出菌落接种于新的PDA 培养基上进行纯化培养，并根据形态学观察及显微镜下拍摄的菌丝形态鉴定[13]。

2 结果与分析

2.1 小鼠体况观察及剖检结果

向小鼠注射菌悬液后，接种部位接种后前8 天并无明显异常表现(图1-a)；接种后第9～10 天开始发病，接种部位出现小面积红斑，皮肤出现结节状损伤，但并未影响到主要器官，各器官之间未粘连，小鼠也并未有明显瘙痒等症状(图1-b)；第11～25天发病明显，接种部位红斑面积增大，并且结节状皮肤损伤深，接种处颜色变深，疑似溃疡性皮损，触感有增生物，小鼠开始有瘙痒感，饮食明显减少等症状明显(图1-c)；第26～30 天接种部位皮肤损伤更深入，有窦道形成，甚至出现局部坏死，增生物触感更加明显，出现黏膜粘连(图1-d)。对照组同样部位注射等量生理盐水后未出现肉眼可见病理变化(图1-e、f、g)。

图1 供试小鼠的剖检症状 Fig.1 Autopsy symptoms of the studied mice

2.2 真菌逆培养结果

结合文献[6]中采用的方法，确定引起小鼠感染的是本次接种的枝孢样枝孢霉(图2)。

图2 枝孢样枝孢霉菌丝和孢子的显微特征 Fig.2 Microcharacteristics of hyphae and spore of C. cladosporioides

2.3 小鼠组织病理学观察结果

由图3 可知，对照组小鼠的病理学结果无异常。 试验组小鼠组织切片前8 天无异常(图4-a、b)；第9～10 天出现表皮粗糙，表皮基底细胞层局部液化，角质层内和表皮内可见孢子，真皮浅层周围出现小灶状浸润并发多种细胞浸润现象，并出现一些脓肿(图4-c、d)；第11～25 天，HE 染色下观察发现由上皮样细胞、组织细胞、淋巴细胞等多种细胞构成的肉芽肿，浸润蔓延至脂肪层，PAS 染色下肉芽肿内偶见分枝的菌丝体(图4-e、f)；第26～30 天，PAS染色下观察发现在脓肿、炎症部、脂肪层浸润部有多核巨噬细胞吞噬的菌体和各形孢子，且浸润处皮脂腺毛囊出现严重破损，偶见异色条带(图4-g、h)。

图3 对照组小鼠的病理组织学特征 Fig.3 Histopathological features of the control group

图4 试验组小鼠的病理组织学特征 Fig.4 Histopathological features of the tested group

如表1 所示，接种后第1～3 天小鼠免疫细胞数快速减少，之后缓慢下降，直至第8 天降至最少，表明机体为了清除感染的真菌而动用机体免疫细胞，机体与该菌处于相持阶段，即潜伏期，第9～13天免疫细胞快速增多至顶峰，第14 天开始逐步呈波动性下降趋势，至第17 天后趋于平稳；接种第1、2 天小鼠体内枝孢样枝孢霉孢子快速减少，第3～16天缓慢减少，维持在相对平稳的水平，第17 天急剧增多达到1 个小高峰之后逐渐减少至第22 天，第23 天又开始缓慢增长，第25 天突然增多又达到1个小高峰后快速减少，第28天之后未观察到孢子；接种第1 天菌丝数量较高，第2 天快速减少后缓慢减少至第5 天，第6 天跳跃式增多后至第12 天趋于稳定，第13 天再减少至消失，第13～15 天均未观察到菌丝，第16～17 天快速增多达到1 个小高峰后又快速减少至第21 天，第21～24 天均未观察到菌丝，第25 天出现大量菌丝，数量达到最高，第26 天后菌丝快速减少，第27 天后未观察到菌丝。

表1 枝孢样枝孢霉感染小鼠后不同时期病理切片中免疫细胞与菌丝和孢子数 Table 1 The number of immune cells, mycelia and spores in the pathological sections of mice infected with C. cladosporioides

3 讨论

一般来说，传染病的病程发展大致可以分为潜伏期、前驱期、明显(发病)期和转归(恢复)期4 个阶段[14]。潜伏期指的是从病原体侵入并繁殖开始，到症状出现为止的这段时间。本试验中，菌悬液注入小鼠体内后，第1～8 天枝孢样枝孢霉逐渐被机体的免疫细胞识别并吞噬，同时枝孢样枝孢霉也启动自身的防卫机制，以逃避被机体的免疫系统吞噬或清除，前8 天小鼠体况正常，接种部位无异常表现，可视为潜伏期。传染病的潜伏期时间长短差异由具体微生物的种类和数量决定，同时还与动物的种类和免疫状态有关。在预试验中，小鼠两侧注射液体积为0.1 mL，在预定试验时间中大部分小鼠未发病或发病体征不明显，解剖后也未见明显病理变化；因此，在正式试验中增加了注射量。通常情况下，慢性及症状不明显的传染病潜伏期时间长短差异较大且无规律，急性传染病则恰恰相反。同种传染病，如果潜伏期比较短，一般来说疾病症状会比较严重；若潜伏期较长时，疾病症状则会比较轻缓。处于潜伏期中的动物是最危险的传染来源，必须对其密切关注。

前驱期是疾病的征兆阶段。一般来说当疾病处于前驱期时患病动物的临床症状初显，主要包括体温升高、食欲不振、精神异常等常规症状，特征性症状不明显，这些症状不能确诊动物所患疾病[14]。本试验第9～10 天接种部位出现小面积红斑，皮肤出现结节状损伤，但并未影响到主要器官，未使各器官之间粘连，小鼠也并未有明显瘙痒等症状，可视为前驱期。第9～13 天免疫细胞明显增多，并在第13 天达到顶峰，而菌丝和孢子数逐渐减少。具体病例不同，前驱期的长短也会不同，一般病症的前驱期只有几小时。

疾病度过前驱期后，特征性症状会慢慢的明显起来，这个阶段是疾病愈演愈烈的重要时期，称为发病期[14]。因发病期很多有代表性的特征性症状相继出现，很容易诊断出具体病症[15]。本试验第11～25 天接种部位红斑面积增大，并且结节状皮肤损伤深，接种处颜色变深，疑似溃疡性皮损伤，触感有增生物，小鼠开始有搔痒动作，饮食明显减少等症状明显，可视为明显发病期。第14～15 天免疫细胞数下降，但仍处于高水平，此时孢子和菌丝数下降到最少；第16～17 天免疫细胞数出现轻微波动，孢子和菌丝数急剧增多，同时免疫细胞转化为脓肿更为明显。这可能是小鼠体内免疫细胞与真菌发生剧烈反应的过程，小鼠机体被消耗，免疫系统被攻击，之后免疫细胞数趋向平缓，孢子数与菌丝数逐渐下降，孢子数在第21～24 天趋于稳定，这期间也未观察到菌丝。

脓肿往往是由于微生物感染机体以后，炎症组织在微生物产生的毒素或酶的作用下发生坏死、溶解，形成脓腔，腔内的渗出物、坏死组织、脓细胞和细菌或真菌等共同组成脓液[16]，由此脓肿逐渐产生。推测小鼠的脓肿可能为坏死溶解的肌肉组织和免疫细胞。目前，真菌引起脓肿的病例越来越多[17]。本试验中产生的脓肿与郑文爱等[18]报道的极细枝孢霉引起的罕见足踝部脓肿样感染相似。肉芽肿是由巨噬细胞及其演化的细胞局限性浸润和增生所形成的界限清晰的结节状病灶。在此期间逐渐出现肉芽肿，由于免疫细胞的减少，推测可能是巨噬细胞转化为肉芽肿。本病例所产生的肉芽肿与桑红等[19]报道的一致。

疾病度过发病期后会逐渐发展进入转归期，在这个阶段如果病原体的致病能力増强或动物体的抵抗力降低，那么整个传染过程以动物死亡为转归；相反，如果病原体的致病能力减弱或者动物体的抵抗力增强，则动物可逐渐恢复健康，临床表现为特殊性症状逐步消失，临床症状慢慢减缓，体内的病理变化逐渐减弱，正常的生理机能逐步恢复。动物体会在一段时间里保留其免疫学特性，病后一定时间内还会有带菌(毒)、排菌(毒)现象，但最后病原体会被逐渐消灭[14]。第26～30 天接种部位皮肤损伤更深入，有窦道形成，甚至出现局部坏死，增生物触感更加明显，出现黏膜粘连，可视为转归期。第25 天，孢子菌丝数突然急剧升高，一直到第27天又快速下降，之后孢子菌丝没再出现，很可能是到达了转归期。

李静[20]的研究中，红色毛癣菌在小鼠足部组织进行长达21 d 的感染，小鼠足部组织可见表皮过度角化，真皮内形成肉芽肿，内有中性粒细胞、淋巴细胞等大量炎细胞浸润，同时还可见大片区域坏死，本试验中枝孢样枝孢霉侵染小鼠腹部表皮明显发病期与其类似。本试验还发现公鼠普遍发病情况较母鼠严重，肉芽肿范围更大，浸润更深，黏膜粘连更严重，可能与性激素调控有关，但还需进一步试验验证。李静[20]还发现红色毛癣菌感染小鼠后，经PAS 染色后发现大量分隔菌丝，本次试验也与其类似，但时间上红色毛癣菌接种21 d 后才观察到明显发病期的病理结果，表明枝孢样枝孢霉的致病力可能强于红色毛癣菌。

4 结论

枝孢样枝孢霉对小鼠有明显的侵染过程，潜伏期为第1～8 天，该时期体表特征变化不明显；前驱期为第9～10 天，该时期接种部位出现小面积红斑，皮肤出现结节状损伤；发病期为第11～25 天，该时期接种部位红斑面积增大，损害加大，颜色变深，触感有增生物，小鼠搔痒，饮食减少；之后属于转归期，小鼠饮食持续减少，接种部位出现局部坏死、粘连等症状，并随时间推移症状加重。