hsa-miR-206过表达调节MAPK通路抑制卵巢癌细胞CAOV3生长及运动

徐 瑶，邓晓杨, 张 勇,3，吴 雯，肖 琳，张小虎

卵巢癌是一类发病率较高的妇科恶性肿瘤，死亡率在妇科恶性肿瘤中居首[1]。调查[2]显示，约65%的卵巢癌患者处于癌症晚期，经手术及放化疗后仍预后不良，5年生存率≤30%。此外，近年来卵巢癌患者趋于低龄，卵巢癌发病率逐年递增[3]，因此寻找有效治疗方法显得十分迫切。微小型RNA miR-206在卵巢癌中发挥抑癌作用，可抑制癌细胞的生长和癌组织的转移[4]。而miR-206在卵巢癌中的抑癌机制还有待进一步研究。因此，该文通过上调miR-206，对其在卵巢癌细胞CAOV3中的作用机制进行了深入探究，为miR-206靶向治疗卵巢癌提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株与主要试剂卵巢癌细胞CAOV3购自美国典型培养物保藏中心；荧光素酶系统检测试剂盒、反转录试剂盒、实时定量PCR试剂盒和Lipofectamine2000转染试剂盒均购自美国Thermo Fisher公司；TRIzol及Opti-MEM均购自美国Invitrogen公司；miR-206 mimic和pc-MAPK1质粒由上海生工生物设计并合成；Brdu试剂盒购自瑞士Roche公司，Transwell小室购自美国Corning公司；促分裂原活化蛋白激酶1 (mitogen activated protein kinase 1，MAPK1)、上皮型钙黏附蛋白(epithelial calcium adhesive protein，E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、cAMP反应元件结合蛋白(CAMP reactive element binding protein，CREB)、P-CREB、Ets样转录因子-1(Ets-like transcription factor-1，Elk-1)、P-Elk-1、原癌基因(proto-oncogene，c-Myc)及P-c-Myc兔来源单克隆一抗抗体购自美国Abcam公司；实验所用二抗均购自上海博士德生物公司；RPMI 1640培养液、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自美国Gibco公司，青霉素、链霉素、RIPA裂解液、DAPI及BCA试剂盒购自上海碧云天公司。

1.2 细胞培养与分组转染体积分数10% FBS、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的RPMI 1640，37℃、5% CO2培养。细胞传代次日换液，融合率达到85%时，以1×104个/ml的浓度再次传代。将细胞分为Control、miR-206 mimic、pc-MAPK1及miR-206 mimic+pc-MAPK1组，根据Lipofectamine 2000说明书将miR-206 mimic质粒、pc-MAPK1质粒分别或联合转染进入miR-206 mimic、pc-MAPK1及miR-206 mimic+pc-MAPK1组CAOV3细胞，Control组加入等量空载。转染6 h后换液，用于后续研究。

1.3 qRT-PCR检测miR-206及MAPK1 mRNA水平将经或未经miR-206转染的CAOV3细胞及其移植瘤组织中加入TRIzol于通风橱中裂解，参考Thermo Fisher总RNA提取试剂盒说明书进行抽提，将得到的总RNA进行定量分析，每组取等量RNA反转录为cDNA，利用实时定量PCR试剂盒配制PCR体系进行PCR扩增，得到阈值Δct，以对照组2ΔΔCt平均值为基准1，实验组2ΔΔCt平均值与对照组2ΔΔCt平均值相比得到的2ΔΔCt为相对变化倍数。

1.4 Brdu检测CAOV3细胞增殖1.2中各组细胞以1.5×105个/ml的浓度接种于6孔板中，培养24 h后，加入10 μmol/L Brdu孵育8 h，PBS洗去未结合Brdu，以含95%乙醇、5%冰乙酸的固定液固定细胞，洗涤后加入Brdu单抗(1 ∶1 000)4℃过夜，二抗(1 ∶200)室温避光孵育1 h。洗涤后DAPI复染细胞核，荧光显微镜观察并计数。

1.5 Transwell检测CAOV3细胞侵袭Matrigel于4℃预先融化，取少量融化Matrigel到Transwell小室中预包被。接种1.2中各组细胞于上室中，用无血清培养液进行培养。24 h后，棉签拭去滤膜上层未迁移细胞，HE染色液对迁移下层细胞进行染色并计数。

1.6 Western blot法检测相关蛋白表达RIPA裂解液提取1.2中各组细胞总蛋白，BCA试剂盒进行定量并调平，取各组蛋白30 μg，质量分数为10% SDS-PAGE将其分离，半干转膜法将其转移到PVDF膜上，脱脂奶粉2 h室温封闭，一抗(GAPDH：1 ∶1 000，MAPK1：1 ∶1 000，vimentin：1 ∶1 000，E-cadherin：1 ∶1 000，P-CREB：1 ∶1 000，CREB：1 ∶1 000，P-Elk-1：1 ∶1 000，Elk-1：1 ∶1 000， P-c-Myc：1 ∶500，c-Myc：1 ∶500)4℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔单克隆二抗(1 ∶2 000)37℃ 1 h，最后曝光显色并以GAPDH为内参。

2 结果

2.1 hsa-miR-206与MAPK1靶向关系生物信息网站TargetScan预测hsa-miR-206与MAPK1之间存在潜在靶向关系。与Control组相比，miR-206 mimic组miR-206表达上调(t=4.86，P<0.001)。各组间MAPK1表达水平差异有统计学意义(F=338.125，P=0.003)；与Control组相比，miR-206 mimic组MAPK1表达下调(t=3.34，P=0.009)，pc-MAPK1组MAPK1表达上调(t=3.38，P=0.008)；与miR-206 mimic组比较，mimic+pc-MAPK1组MAPK1表达上调(t=3.35，P=0.009)。各组间荧光素酶活性差异有统计学意义(F=187.364，P=0.006)；转染miR-206 mimic可降低MAPK1 wt的荧光素酶活性，而对两者结合位点突变的MAPK1 mut没有影响。见图1。

2.2 miR-206 mimic及pc-MAPK1对CAOV3细胞增殖影响4组间荧光素酶活性差异有统计学意义(F=543.297，P=0.000)；与Control组BrdU阳性细胞百分比(68.12±9.23)%比较，miR-206 mimic组BrdU阳性细胞百分比(9.54±5.12)%下降(t=4.27，P=0.002)，pc-MAPK1组BrdU阳性细胞百分比(94.34±6.27)%上升(t=3.45，P=0.008)。与miR-206 mimic组BrdU阳性细胞百分比(9.54±5.12)% 比较，miR-206 mimic+pc-MAPK1组BrdU阳性细胞百分比(56.62±7.13)%上升(t=4.11，P=0.003)。见图2。

2.3 miR-206 mimic及pc-MAPK1对CAOV3细胞侵袭影响4组间荧光素酶活性差异有统计学意义(F=621.377，P=0.000)；与Control组侵袭细胞数(55.12±9.23)比较，miR-206 mimic组侵袭细胞数(11.14±5.17)减少(t=3.43，P=0.008)，pc-MAPK1组侵袭细胞数(164.22±23.21)增多(t=3.52，P=0.007)。与miR-206 mimic组侵袭细胞数(11.14±5.17)比较，miR-206 mimic+pc-MAPK1组侵袭细胞数(45.32±9.11)增多(t=3.33，P=0.009)。见图3。

2.4 miR-206 mimic及pc-MAPK1对CAOV3细胞上皮间充质转化影响4组间E-cadherin表达量和vimentin表达差异均有统计学意义(F=623.764，P=0.000；F=889.463，P=0.000)。与Control组比较，miR-206 mimic组细胞中E-cadherin表达增加(t=4.13，P=0.003)、vimentin表达减少(t=3.51，P=0.007)，pc-MAPK1组E-cadherin表达减少(t=3.27，P=0.010)、vimentin表达增加(t=3.31，P=0.009)。与miR-206 mimic组比较，miR-206 mimic+pc-MAPK1组E-cadherin表达减少(t=4.02，P=0.003)，vimentin表达增加(t=3.36，P=0.009)。见图4。

图1 miR-206与MAPK1靶向关系

A：miR-206与MAPK1之间的连续结合片段；B：miR-206 mimic对miR-206影响；C：miR-206 mimic及pc-MAPK1对MAPK1影响；D：荧光素酶活性实验检测miR-206与MAPK1靶向关系；与Control组比较：**P<0.01；与miR-206 mimic组比较：##P<0.01；与MAPK1mut组比较：△△P<0.01

图2 BrdU染色检测各组CAOV3细胞增殖情况 BrdU×400

图3 Transwell检测各组CAOV3细胞侵袭情况 结晶紫×400

图4 Western blot法检测各组CAOV3细胞vimentin和E-cadherin蛋白表达

与Control组比较：**P<0.01，与 miR-206 mimic组比较：##P<0.01

2.5 miR-206 mimic及pc-MAPK1对CAOV3细胞MAPK信号通路的影响各组间P-CREB/CREB、P-Elk-1/Elk-1、P-c-Myc/c-Myc表达量比值差异有统计学意义(F=468.392，P=0.000；F=143.674，P=0.001；F=697.314，P=0.000)。与Control组比较，miR-206 mimic组细胞中P-CREB/CREB、P-Elk-1/Elk-1及P-c-Myc/c-Myc比值降低(t=3.27，P=0.010；t=3.26，P=0.010；t=3.28，P=0.010)，pc-MAPK1组P-CREB/CREB、P-Elk-1/Elk-1及P-c-Myc/c-Myc比值升高(t=3.31，P=0.009；t=3.29，P=0.010；t=3.34，P=0.009)。与miR-206 mimic组比较，miR-206 mimic+pc-MAPK1组P-CREB/CREB、P-Elk-1/Elk-1及P-c-Myc/c-Myc比值升高(t=3.27，P=0.010；t=3.28，P=0.010；t=3.29，P=0.010)。见图5。

2.6 miR-206 mimic对CAOV3细胞裸鼠皮下移植瘤影响与Control组裸鼠皮下移植瘤体积(2134.26±199.33)mm3比较，miR-206 mimic组(496.21±187.13)mm3减小(t=6.51，P<0.001)。与Control组相比，miR-206 mimic组移植瘤组织中miR-206表达增加(t=4.65，P=0.001)，MAPK1 mRNA水平降低(t=3.86，P=0.004)，miR-206 mimic组VEGF表达及P-Elk-1/Elk-1及P-c-Myc/c-Myc比值降低(t=3.37，P=0.009；t=3.34，P=0.009；t=3.40，P=0.008)，Ki67及Vimentin阳性细胞百分比减少(t=4.45，P=0.002；t=4.22，P=0.002)。见图6。

图5 Western blot法检测各组CAOV3细胞P-CREB/CREB、P-Elk-1/Elk-1及P-c-Myc/c-Myc水平

3 讨论

miRNA是一类用于调节靶基因表达的小型单链非编码RNA，在各种细胞增殖、分化、发育和凋亡过程中发挥着至关重要的作用。miR-206作为一类抗癌基因，在卵巢癌细胞中被下调，上调miR-206表达可抑制卵巢癌发生发展[5]。miR-206可调节多个基因表达，在乳腺癌中，miR-206可靶向下调烟酰胺磷酸核糖转移酶、转化生长因子及T-box录因子[6]；在胃癌中，miR-206可降低c-Met、周期蛋白依赖性激酶4及MAPK1的表达水平[7]。本研究利用生物信息预测显示，在CAOV3细胞中miR-206可靶向下调MAPK1表达。

图6 miR-206 mimic对CAOV3细胞裸鼠皮下移植瘤的影响

A：CAOV3细胞移植瘤照片；B：Western blot法检测VEGF、P-Elk-1/Elk-1及P-c-Myc/c-Myc水平；C：qRT-PCR检测miR-206及MAPK1 mRNA水平，1：Control组；2：miR-206 mimic组；D：免疫组化检测Ki67和vimentin表达 ×200；与Control组比较：**P<0.01

过度增殖及侵袭迁移是癌细胞的生长特性，降低癌细胞增殖及侵袭能力可抑制癌组织生长转移。研究[6]表明，miR-206可靶向下调多个促癌基因，抑制癌细胞增殖及侵袭。在肾细胞癌中，miR-206通过抑制细胞周期蛋白G相关激酶表达，降低癌细胞增殖及侵袭能力[8]；在卵巢癌中，miR-206抑制其靶蛋白细胞周期蛋白D1及D2表达，阻碍癌组织的生长转移[5]。在本文中，在卵巢癌细胞CAOV3中，miR-206可通过靶向下调MAPK1抑制细胞的增殖及侵袭。

上皮间充质转化是促进癌细胞侵袭迁移的重要因素之一，其在蛋白水平上主要表现为E-cadherin表达减少，Vimentin表达增加。细胞黏附蛋白E-cadherin定位于上皮细胞中，主要维持细胞极性及完整性，是细胞增殖和侵袭的抑制因子[9]。波形蛋白Vimentin是上皮间充质转化过程中的关键蛋白，可作为上皮间充质转化的经典标记物，在上皮间充质转化过程中，细胞骨架组分由以角蛋白为主转变为以波形蛋白为主[10]。本研究表明，miR-206可通过靶向下调MAPK1阻碍CAOV3细胞上皮间充质转化。

MAPK1信号通路在癌症形成过程中发挥重要作用，如，在子宫内膜癌中，MAPK1过度激活可促进癌细胞的增殖侵袭及迁移[11]。据报道[12]，在卵巢癌中，抑制MAPK1表达可提高癌细胞对铂类化合物的敏感性。cAMP反应元件结合蛋白CREB、Ets样转录因子Elk-1及原癌基因c-Myc均为MAPK1的下游蛋白，CREB是转录增强因子，主要定位于细胞核中，当其被MAPK1磷酸化激活后可促进MAPK1靶基因的转录[13]；Elk-1是促癌基因，可通过调节细胞外基质相关酶的转录在癌组织浸润转移和血管形成中发挥重要作用[14]；c-Myc具有的增殖效应，能使细胞具有无限增殖的能力，可促进多种癌症发生发展[15]。实验结果表明，miR-206可通过靶向下调MAPK1抑制MAPK1信号通路的激活。

综上所述， miR-206过表达通过靶向下调MAPK1抑制MAPK1信号通路来抑制卵巢癌细胞CAOV3生长及运动，这为靶向治疗卵巢癌提供新的靶点。但是具体分子机制还有待进一步研究。