TIMP-4和MMP-2在胃癌中的表达

孔 晋,吴文涌, 吴正升

胃癌(gastric cancer，GC)是世界第五大常见的癌症，近年来发病率在不断上升[1]。胃癌预后较差，5年生存率低于30%，部分原因是肿瘤细胞的快速侵袭和转移[2]。侵袭与转移是恶性肿瘤的重要生物学行为之一，其过程包括细胞转移相关基因基质金属蛋白酶家族(matrix metalloproteinase family, MMPs)、金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMP)等的失调。细胞外基质(extracellular matrix，ECM)蓄积是肿瘤侵袭和转移的重要因素。ECM受MMPs及其内源性抑制剂TIMPs的调节。MMPs组织TIMP-4是一种抑制MMPs活性的蛋白质。研究[3]表明TIMP-4表达与神经胶质瘤的预后、分期及疾病进展相关。TIMP-4在胃癌中的表达情况及其与患者预后关系的研究较少。TIMP-4通过抑制 MMPs介导的活化来调节明胶酶A的活性。MMP-2是恶性肿瘤侵袭和转移的标志，参与ECM和基底膜Ⅳ型胶原的降解，在细胞迁移过程中起重要作用[4]。因此该研究从蛋白水平探讨胃癌中TIMP-4和MMP-2表达情况，并分析两者之间关联性，为研究GC 的发生、发展机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 病例资料收集安徽医科大学第一附属医院2013年10月～11月通过手术切除经病理证实的、临床病理资料完整的GC组织存档蜡块75例。所有患者术前均未接受过放疗、化疗或生物治疗等干预措施。其中男 55例，女20例，年龄35～81(62±10.22)岁；肿瘤直径≤5 cm 44例，>5 cm 31例；淋巴结转移54例，无淋巴结转移21例；按胃癌分化程度：中高分化腺癌30例，低分化腺癌45例；按第8版国际抗癌联盟和美国癌症联合委员会胃癌TNM分期标准[5]：Ⅰ期+Ⅱ期36例，Ⅲ期+Ⅳ期39例。收集相应癌旁组织(距癌组织边缘2 cm以上)存档蜡块42例。参与本次研究的所有患者均同意并签署知情同意书。相关样品的收集和处理都是在遵守《赫尔辛基宣言》[6]的情况下进行并经安徽医科大学第一附属医院伦理委员会批准。

1.2 主要试剂与仪器兔抗人TIMP-4(12326-1-AP，工作浓度1 ∶100)多克隆抗体及鼠抗人MMP2(66366-1-1g，工作浓度1 ∶75)单克隆抗体均由美国Proteintech Group公司生产；即用型快速免疫组化MaxVisionTM检测试剂盒(KIT5020)购自福州迈新公司；DAB显色剂(ZLI9018)购自北京中杉金桥生物技术有限公司；OlympusCX22生物显微镜购自日本Olympus公司。

1.3 实验方法所有收集的组织存档蜡块经4 μm厚连续切片，行免疫组织化学染色。染色结果经2名经验丰富的病理科医师采用双盲原则评定。免疫组化染色采用EnVision法。主要步骤如下：4 μm厚的石蜡切片65 ℃烤片，脱蜡水化，经柠檬酸钠缓冲液高压加热抗原修复，3% H2O2作用10 min阻断内源性过氧化物酶的活性。一抗(MMP-2、TIMP-4)4 ℃过夜孵育，PBS清洗后每张切片滴加生物素标记的二抗工作液，37 ℃干燥箱孵育30 min，DAB显色剂显色，苏木精复染，常规脱水，透明，封片。显微镜下观察染色情况，阳性对照使用MMP-2、TIMP-4表达良好的胃组织，PBS代替一抗作阴性对照。

1.4 结果判断对TIMP-4和MMP-2的表达水平进行半定量的评估。显微镜下观察切片，以细胞质内出现明显的棕黄色颗粒为阳性。对阳性细胞进行染色程度的得分评判，同时对阳性细胞进行计数。将染色强度和阳性细胞百分比结合判断TIMP-4和MMP-2蛋白免疫组化结果。结果判断采用半定量积分法：① 着色强度打分：0分，细胞无着色；1分，细胞着色为浅黄色；2分，细胞着色为棕黄色；3分，细胞着色为棕褐色；染色强度需与背景着色相对比。② 根据阳性细胞所占百分比打分：0分，阴性；1分，阳性细胞≤10%；2分，阳性细胞>10%～50%；3分，阳性细胞>50%～75%；4分，阳性细胞>75%。按着色强度分值与阳性细胞百分比分值乘积结果将切片分为4个等级：“-”：0～2分；“+”：3～5分；“”： 6～8分；“”：9～12分；以≥3分判定为免疫反应阳性[7]。

1.5 Kaplan-Meier生存分析和临床表达分析Kaplan-Meier plotter(http://kmplot.com/analysis/)是一个综合的在线平台，可基于10 293例癌症样品评估54 675个基因对生存的影响。本研究使用Kaplan-Meier绘图仪评估TIMP-4和MMP-2的预后价值及其在胃癌患者中的表达。从TCGA数据库获得527例胃癌组织和349例癌旁组织中TIMP-4 mRNA表达数据；以及570例胃癌组织和306例匹配的癌旁正常组织中MMP-2 mRNA表达数据。

1.6 统计学处理采用SPSS 23.0软件进行分析，各组间比较采用χ2检验，指标间的相关性分析采用Pearson相关分析。构建Kaplan-Meier曲线以确定患者总生存率(overall survival,OS)。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TIMP-4和MMP-2蛋白在GC组织以及癌旁组织中的表达TIMP-4和 MMP-2和蛋白均定位于细胞质，蛋白阳性表达时染色呈棕黄色颗粒(图1)。75例GC组织中，65例(86.67%)TIMP-4蛋白阳性表达，有68例(90.67%)MMP-2蛋白表达为阳性；而在42例癌旁组织中，仅22例(52.38%)TIMP-4阳性表达，23例(54.76%)MMP-2蛋白表达为阳性。TIMP-4蛋白与MMP-2蛋白在胃癌组织表达均较癌旁组织中高且差异均有统计学意义(P<0.001)(表1)。

图1 胃癌组织与癌旁组织中TIMP-4和MMP-2免疫组化结果 En Vision法×200

2.2 TIMP-4和MMP-2蛋白在GC患者中的表达与相关临床病理参数的关系在胃癌患者中，TIMP-4蛋白表达与性别、年龄、肿瘤大小、淋巴结转移、肿瘤分化程度及分期均无统计学意义(P>0.05)。MMP-2蛋白的高表达与淋巴结转移及胃癌分期相关且差异有统计学意义(P<0.001)；但与性别、年龄、肿瘤大小以及分化程度无相关性，见表2。

表1 TIMP-4蛋白和MMP-2蛋白在胃癌组织和癌旁组织中的表达(n)

表2 TIMP-4和MMP-2蛋白表达和临床病理特征的关系[n(%)]

2.3 GC组织中TIMP-4和MMP-2表达的相关性分析Pearson相关分析表明，在75例GC组织中TIMP-4和MMP-2表达水平呈正相关且有统计学意义(r=0.351,P<0.001)。

2.4 TIMP-4和MMP-2 Kaplan-Meier生存分析和临床表达分析使用在线生物信息学工具Kaplan-Meier绘图仪检索，结果显示TIMP-4、MMP-2高表达的胃癌患者OS降低(图2)。

3 讨论

根据世界卫生组织的数据，胃癌是全球最常见的第五种癌症和第三大癌症死亡原因[1-2]。在我国胃癌死亡率居全国第二，由于缺乏特异性的早期筛查和诊断方法，大量胃癌患者在初诊时已进展到晚期，预后较差，5年生存率不超过25%[8]。胃癌作为最常见的恶性肿瘤之一，早期诊断和治疗已成为一个亟待解决的问题。研究[9]表明幽门螺杆菌感染、细胞增殖与细胞周期功能障碍、血管生成细胞浸润和转移等一系列复杂的分子生物学过程参与了胃癌的发生发展。肿瘤侵袭和转移是胃癌患者死亡的主要原因[10]。然而，胃癌转移的机制尚不完全清楚。因此，有必要对胃癌转移等生物学行为进行研究，为制定最有效的个体化治疗方案，提高临床疗效提供理论依据。

TIMP-4是一种抑制金属蛋白酶活性的蛋白质，通过有效抑制MT1MMP介导的活化来调节明胶酶A的活性。有研究[11]表明TIMP-4在乳腺癌中高表达能够抑制肿瘤生长、在子宫内膜癌中TIMP-4过表达与侵袭有关、而在宫颈癌中TIMP-4高表达与疾病晚期相关。然而TIMP-4在胃癌中的作用仍未见报道。蛋白水解酶在细胞外基质的降解过程中起着关键的作用，MMPs是一种重要的蛋白水解酶[12-13]。MMP-2作为MMPs家族的重要成员，在胃癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌等多种肿瘤中高表达，其表达与肿瘤分期、淋巴浸润、淋巴结转移及复发密切相关[14-15]。

图2 基于TIMP-4、MMP-2的总生存期Kaplan-Meier生存曲线

本研究分析了75例胃癌组织及42例癌旁组织中MMP-2蛋白和TIMP-4蛋白表达水平。结果显示90.67%的胃癌组织中MMP-2蛋白阳性表达，并且MMP-2蛋白高表达与肿瘤淋巴结转移显著相关(P<0.001),同时与胃癌分期存在一定统计学关联，这与前人的研究[9]是一致的，说明MMP-2可以作为预测胃癌预后的潜在标志物；75例胃癌组织中TIMP-4蛋白的阳性表达率为86.67%，高于癌旁组织，但与胃癌转移、分期和分化程度等无明显统计学关联。说明TIMP-4可能作为胃癌早期诊断的标志物。Spearman相关性分析显示，胃癌组织中MMP-2蛋白表达水平与TIMP-4蛋白表达水平有统计学相关性且呈正相关关系(r=0.351,P<0.001)，说明联合检测 MMP-2与TIMP-4这两项指标更有助于胃癌患者的诊断及预后评估。同时Kaplan-Meier生存分析验证了肿瘤患者中MMP-2、TIMP-4高表达，并预示着更短的总生存期(P<0.05)。

综上，MMP-2与TIMP-4在胃癌组织中高表达，且其高表达均提示胃癌患者预后较差，可作为胃癌诊断和预后的潜在标志物。