黑芝麻总黄酮的体内抗氧化作用研究

王 荣，赵 佳，冯 怡，秦 蓓

(西安医学院 药学院，西安 710021)

黑芝麻为胡麻科芝麻的种子，具有药食同源的特性。现代药理学研究表明，黑芝麻具有抗衰老、降压、促进黑素生成等多种药理活性，而这些药理活性主要与其抗氧化作用有关[1]。黑芝麻富含木脂素、多酚、不饱和脂肪酸、黄酮等生物活性成分[2]。目前已有文献报道黑芝麻中木脂素的抗氧化作用[3]，张伶俐[4]研究了芝麻油对D-半乳糖诱导的HepG2细胞氧化应激的保护作用，但以上研究并不能完全解析黑芝麻抗氧化的物质基础。已有研究表明黄酮类化合物具有抗氧化活性[5-6]，但黑芝麻中黄酮的抗氧化作用还未见报道。自由基损伤是目前被科学界所共识的衰老机制。皮下注射D-半乳糖是经典的衰老造模方法[7-8]，该模型通过连续大剂量注射D-半乳糖造成小鼠体内糖代谢紊乱[9]，目前认为该模型最接近自然衰老的规律。D-半乳糖能够改变脑内的氧化应激状态，使自由基清除减缓，过量的自由基引起机体衰老。生物体内存在清除自由基的酶系，如超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等。该酶系可通过氧化还原反应将自由基氧化，而抗氧化酶系会随机体年龄增加而减弱。丙二醛(MDA)是活性氧损伤细胞线粒体系统时所产生的脂质过氧化物，被认为是衰老模型重要的指标[10]。脾脏和胸腺是机体的主要淋巴器官，D-半乳糖连续大剂量注射可引起脾脏和胸腺初始T细胞水平下降，进而导致免疫老化[11]。本研究通过D-半乳糖注射构建小鼠衰老模型，选择通过检测小鼠脏器指数以及小鼠血清和脑组织中的总SOD、GSH-Px活性和MDA含量变化，研究黑芝麻中黄酮的体内抗氧化活性。

1 材料与方法

1.1 实验材料

黑芝麻，购自西安贝斯特药材市场。采用超声提取法提取黑芝麻总黄酮，提取条件为65%乙醇、料液比1∶33、超声时间50 min，以芦丁为标准品，紫外分光光度法测得总黄酮得率为1.65%。

雄性昆明小鼠48只，购自成都达硕实验动物有限公司，体重(20±2)g，动物生产许可证号为SCXK(川)2015-030。

芦丁标准品(批号Y16M9S61523，含量98%)，上海源叶生物科技有限公司；谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测试盒、BCA法蛋白定量测试盒、总超氧化物歧化酶(T-SOD)测试盒、丙二醛(MDA)测试盒，南京建成生物工程研究所。

1510型自动全波长酶标仪、Biofuge stratos高速冷冻离心机，Thermo Fisher Scientific；AX224ZH型分析天平，奥豪斯仪器有限公司；YLS-4C型转棒式疲劳仪，济南益延科技发展有限公司；T10型手持匀浆机，IKA公司。

1.2 实验方法

1.2.1 分组建立衰老模型

48只雄性昆明小鼠适应性饲养3 d，分为两组，空白组8只，其余为模型组。空白组颈部皮下注射生理盐水，模型组颈部皮下注射D-半乳糖(0.5 g/kg)，注射剂量为0.1 mL/10 g，注射30 d。建模成功后将40只模型小鼠随机分为5组，即模型组、阳性组(VC，200 mg/kg)、黑芝麻总黄酮高剂量组(300 mg/kg)、中剂量组(150 mg/kg)和低剂量组(75 mg/kg)，灌胃剂量10 mL/kg，灌胃时间21 d。

1.2.2 小鼠行为学实验测定

给药过程中观察并记录小鼠的精神状态、饮食情况及皮肤毛发状况；利用转棒式疲劳仪和负重游泳实验检测小鼠运动能力，记录小鼠在棒与负重游泳时间，将各组进行比较。

1.2.3 脏器指数测定

脱颈处死小鼠，分离出胸腺、脾脏及脑，用滤纸吸去表面的血，然后进行称量，记录称取的质量，计算脏器指数。

1.2.4 生化指标的测定

小鼠眼眶取血，4℃、3 000 r/min离心10 min，取上清液得血清。取脑组织，加冷藏的生理盐水制备成10%的脑组织匀浆液，取上清液，-20℃冷藏备用。按照说明书对血清和脑组织匀浆液的T-SOD、GSH-Px活力和MDA含量进行测定。

1.2.5 病理学观察

取部分脑组织块，4%多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片、HE染色后，进行病理组织学检查。

1.2.6 数据统计

结果以“均数±标准差”表示。采用SPSS 22.0统计软件进行数据处理，组间比较采用Oneway-ANOVA Dunnett双侧t检验，P<0.05认为差异有统计意义。

2 结果与分析

2.1 黑芝麻总黄酮对衰老小鼠行为学的影响 (见表1)

注：与空白组相比，*表示P<0.05；与模型组相比，#表示P<0.05。下同。

衰老模型小鼠出现掉毛、行动迟缓等现象。由表1可知，模型组与空白组相比，小鼠负重游泳时间和在棒时间均显著缩短(P<0.05)，说明衰老造成小鼠运动能力下降。与模型组相比，阳性组能显著延长小鼠负重游泳时间和在棒时间(P<0.05)；黑芝麻总黄酮高、中、低剂量组均能延长小鼠负重游泳时间，其中高剂量组具有显著差异(P<0.05)，黑芝麻总黄酮高剂量组能延长小鼠在棒时间，但与模型组相比无显著差异(P>0.05)。

2.2 黑芝麻总黄酮对衰老小鼠脏器指数的影响 (见表2)

表2 黑芝麻总黄酮对衰老小鼠胸腺指数、脾脏指数 和脑指数的影响

脾脏和胸腺在人体中起重要的免疫作用，二者体积的缩小表明机体一定程度的衰老。当机体衰老后，一般会伴随着脑萎缩，所以取脑、胸腺、脾脏进行称重，计算其脏器指数。由表2可知，相较于空白组，模型组胸腺、脾脏和脑指数均显著降低(P<0.05)。与模型组比较，VC能增加模型小鼠的胸腺、脾脏和脑指数，但无显著差异(P>0.05)，黑芝麻总黄酮能增加胸腺、脾脏和脑指数，其中高剂量组的脑指数显著升高(P<0.05)。以上结果表明，黑芝麻总黄酮能改善小鼠的衰老。

2.3 黑芝麻总黄酮对衰老小鼠T-SOD、GSH-Px活力和MDA含量的影响(见表3、表4)

表3 黑芝麻总黄酮对衰老小鼠血清中T-SOD、 GSH-Px活力和MDA含量的影响

由表3可知，与空白组相比，模型组小鼠血清中T-SOD和GSH-Px活力显著降低(P<0.05)，MDA含量显著升高(P<0.05)。VC能显著增加模型小鼠血清中T-SOD和GSH-Px的活力(P<0.05)，对MDA含量无显著影响(P>0.05)；黑芝麻总黄酮高、中、低剂量组与模型组相比，血清中T-SOD和GSH-Px活力显著升高(P<0.05)，黑芝麻总黄酮高剂量组显著降低了MDA的含量(P<0.05)。

表4 黑芝麻总黄酮对衰老小鼠脑组织中T-SOD、 GSH-Px活力和MDA含量的影响

由表4可知，与空白组相比，模型组T-SOD和GSH-Px活力显著降低(P<0.05)，MDA含量显著升高(P<0.05)。与模型组相比，VC显著增加了模型小鼠脑组织中T-SOD和GSH-Px的活力(P<0.05)，显著降低了MDA的含量(P<0.05)；黑芝麻总黄酮高、中、低剂量组能显著升高T-SOD的活力(P<0.05)。黑芝麻总黄酮高、中、低剂量组能增加脑组织中GSH-Px活力，但与模型组相比无显著差异(P>0.05)。黑芝麻总黄酮高、中剂量组则显著降低了MDA的含量(P<0.05)。以上结果说明黑芝麻总黄酮能够明显增强小鼠血清和脑组织中T-SOD和GSH-Px活力，并一定程度降低MDA含量，表明其具有一定的抗氧化能力。

2.4 黑芝麻总黄酮对衰老模型小鼠脑组织病理形态的影响(见图1)

图1 黑芝麻总黄酮对衰老模型小鼠 脑组织病理形态的影响

由图1可见，空白组小鼠脑组织细胞排列有序，模型组小鼠脑组织细胞排列松散，核固缩。与模型组相比，黑芝麻总黄酮(300 mg/kg)组小鼠脑组织细胞排列有序，细胞核清晰，明显好转。

3 结 论

本文通过建立D-半乳糖致小鼠亚急性衰老模型，评价了黑芝麻总黄酮的体内抗氧化作用。研究结果表明：黑芝麻总黄酮能延长衰老小鼠负重游泳时间，增加脑指数，改善衰老小鼠脑组织的损伤；黑芝麻总黄酮能显著增加血清中GSH-Px活力，显著增加血清和脑组织中T-SOD活力，同时降低MDA含量。以上结果表明黑芝麻总黄酮通过抗氧化发挥抗衰老活性。