响应面优化芝麻粕中芝麻素酚三糖苷的提取工艺

高锦鸿，芦 鑫，贾 聪，王瑞丹， 孙 强，黄纪念,3

(1.河南省农科院 农副产品加工研究所，郑州 450002； 2.河南省农产品生物活性物质工程技术研究中心， 郑州 450002； 3.农业部油料加工重点实验室，武汉 430062)

目前，国内芝麻加工以芝麻油生产为主，75%的芝麻用于制油[1]。制油过程中会产生大量芝麻饼粕，据测算，我国每年产生50万t以上芝麻饼粕[2]。受加工水平所限，国内芝麻饼粕主要用作饲料与肥料，芝麻饼粕资源未得到充分合理利用。研究表明，芝麻饼粕除含有丰富的蛋白质外，还含有一定的芝麻素酚糖苷。芝麻素酚糖苷是一种水溶性芝麻木酚素，主要以芝麻素酚三糖苷形式存在，其分子式为C38H48O22[3-4]。尽管芝麻素酚三糖苷在体外抗氧化活性较弱[5-6]，但其在体内肠道菌群及β-葡萄糖苷酶作用下可以转化为具有较强抗氧化活性的芝麻素酚及其他酚类化合物，从而降低机体氧化应激水平[7-9]，对健康发挥有益作用，具有研究与应用价值。

目前，从芝麻中提取芝麻素酚三糖苷的方法主要包括磁力搅拌法[10]、超声波辅助法[11]、回流提取法[12]和亚临界提取法[13]。磁力搅拌法及回流提取法具有操作简单，设备成本低的优点，但存在耗时较长，提取率低的问题；亚临界提取法虽耗时较短，效率高，但其设备能耗较高，且不易操作；与前3种方法相比，超声波辅助法对于物质提取具有强化作用，且操作简便，效率高。高锦鸿等[11]以芝麻为原料，乙醇为提取溶剂，研究了乙醇体积分数、料液比、超声提取温度和超声提取时间对芝麻中芝麻素酚三糖苷提取率的影响规律，但未对超声波辅助提取芝麻素酚三糖苷的其他重要影响因素如超声功率、超声波作用方式、pH、转速进行分析。因此，本研究在前期试验的研究基础上，以芝麻粕为原料，利用单因素试验和响应面法优化提取芝麻粕中芝麻素酚三糖苷的工艺参数，并考察超声功率、超声波作用方式、pH、转速对芝麻粕中芝麻素酚三糖苷得率的影响规律，以期为芝麻粕的高值化利用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料与试剂

亚临界芝麻粕：芝麻经轧坯后，以液化气为萃取剂，在亚临界状态下，萃取3次，萃取条件为压力1.0 MPa、萃取温度50℃、料液比1∶3、萃取时间2 h，固液分离后得到亚临界芝麻粕(主要成分：水分(6.86±0.10)%，糖类含量(39.38±0.20)%，蛋白质含量(38.21±0.08)%，灰分含量(10.93±0.16)%，脂肪含量(4.62±0.23)%)。

芝麻素酚三糖苷标准品(实验室自制[11]，液相纯度98.13%)，聚酰胺填料(100～200目)，葡聚糖凝胶LH-20，乙醇、硼酸、凯氏定氮催化剂、浓硫酸、氢氧化钠、盐酸等均为分析纯，甲醇为色谱纯。

1.1.2 仪器与设备

XH-2008DE智能温控双频超声波合成/萃取仪，DL-5-B离心机，TGL-16A离心机，XS205电子天平，RE52-86A型旋转蒸仪，Ultimate 3000高效液相色谱仪，电热恒温鼓风干燥箱，K-05型全自动凯氏定氮仪，KDN-12C数显温控消化炉，TM-0910P陶瓷纤维马弗炉，CMR-420纯水机。

1.2 试验方法

1.2.1 芝麻粕中芝麻素酚三糖苷的提取

称取一定量过60目筛的亚临界芝麻粕样品，置于25 mL具塞锥形瓶中，按照料(芝麻粕质量)液(乙醇溶液体积)比1∶40，加入80%乙醇溶液，放入转子，调节溶液pH，称重，在不同的超声波作用方式、功率及转速下，(40±1)℃恒温提取20 min，提取结束后，冷却，补足到先前称重时的质量，摇匀后静置，吸取上清液，经0.45 μm滤膜过滤后置于进样瓶中，高效液相色谱法定量。

1.2.2 芝麻素酚三糖苷的HPLC测定条件

Agilent 5 TC-C18(2)色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm); 检测波长290 nm；柱温 30℃；进样量10 μL。以流动相甲醇(A)和水(B)进行梯度洗脱：0 min(1 mL/min，40%A)→10 min(1 mL/min,40%A)→15 min(0.8 mL/min,40%A)→35 min(0.8 mL/min,40%A)→40 min(1 mL/min,80%A)→50 min(1 mL/min,80%A)→55 min(1 mL/min,40%A)[11]。

1.2.3 芝麻素酚三糖苷标准曲线的建立

精确称取9.20 mg(精确至0.01 mg)芝麻素酚三糖苷标准品，使用甲醇溶解并定容至50 mL,配成质量浓度为184 μg/mL的芝麻素酚三糖苷母液，稀释成质量浓度分别为7.36、 18.40、55.20、92.00、128.80、165.60 μg/mL的标准溶液。将标准溶液进行HPLC分析，以芝麻素酚三糖苷标准溶液的质量浓度(X) 作为横坐标、峰面积(Y) 作为纵坐标绘制标准曲线。标准曲线回归方程为Y=16.825X-0.493 2，线性相关系数(R2)为0.999 3，线性范围为7.36～165.60 μg /mL。

1.2.4 芝麻素酚三糖苷得率的计算

芝麻素酚三糖苷得率=VC/W

式中:V为提取液体积，mL;C为提取液中芝麻素酚三糖苷的质量浓度，mg/mL;W为亚临界芝麻粕质量，g 。

1.2.5 数据统计分析

所有试验均重复测定3次，结果取平均值。试验数据采用SPSS 16.0软件进行单因素方差分析， 采用Origin 8.5进行单因素制图，采用SAS 9.4进行响应面分析。单因素试验图中相同字母表示各数值之间没有显著性差异。p<0.05 为显著，p<0.01 为极显著。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 超声波作用方式的影响

在超声功率1 200 W、提取液 pH 7.0、转速100 r/min、不同超声波作用方式(连续或间歇)条件下超声提取，研究不同超声波作用方式对芝麻素酚三糖苷得率的影响，结果见图1。

由图1可知：逐渐延长超声波工作时间，芝麻素酚三糖苷得率逐渐升高，当超声波作用方式为连续时，芝麻素酚三糖苷得率最高；随着超声波间歇时间的延长，芝麻素酚三糖苷得率逐渐降低。因此，选择超声波作用方式为连续。

注：作用方式中的数据比为工作时间与间歇时间的比，时间单位为s。

图1 超声波作用方式对芝麻素酚三糖苷得率的影响

2.1.2 超声功率的影响

在提取液pH 7.0、转速100 r/min、不同超声功率条件下连续超声提取，研究不同超声功率对芝麻素酚三糖苷得率的影响，结果见图2。

图1 超声功率对芝麻素酚三糖苷得率的影响

由图2可知，超声功率为0 W时，芝麻素酚三糖苷得率较低，为2.72 mg/g。在0～1 200 W范围内，随着超声功率增大，芝麻素酚三糖苷得率随之提高，这是由于超声功率增大，空化作用和机械作用越强烈，芝麻素酚三糖苷扩散速率增加，从而提升提取液中浓度[14]。超声功率为1 200 W时，芝麻素酚三糖苷得率为4.04 mg/g，与超声功率为0 W相比，芝麻素酚三糖苷得率提高了48.5%。超声功率超过1 200 W后，随着超声功率的增加，芝麻素酚三糖苷得率趋于平稳。故选择超声功率为 1 200 W。

2.1.3 提取液pH的影响

在超声功率1 200 W、转速100 r/min、不同提取液pH条件下连续超声提取，研究不同提取液pH对芝麻素酚三糖苷得率的影响，结果见图3。

由图3可知，在酸性条件下，随着pH的升高，芝麻素酚三糖苷得率整体上逐渐升高，当pH达到7.0时，芝麻素酚三糖苷得率最高，当pH进一步升高，溶液呈碱性时，芝麻素酚三糖苷得率略有下降。这可能是因为酸性条件导致芝麻素酚三糖苷结构不稳定，使其结构降解或转化为其他化合物，而碱性条件下对芝麻素酚三糖苷没有明显的破坏作用，这一结果与文献[15]报道结果一致，进一步说明芝麻素酚三塘苷在pH 7.0时结构比较稳定。因此，选择提取液pH为7.0。

图3 提取液pH对芝麻素酚三糖苷得率的影响

2.1.4 转速的影响

在超声功率1 200 W、提取液pH 7.0、不同转速条件下连续超声提取，研究不同转速对芝麻素酚三糖苷得率的影响，结果见图4。

图4 转速对芝麻素酚三糖苷得率的影响

由图4可知，随着转速的提高，芝麻素酚三糖苷得率逐渐升高，在转速达到400 r/min时，芝麻素酚三糖苷得率最高，随着转速的进一步提升，芝麻素酚三糖苷得率趋于稳定，这说明当转速达到400 r/min时，芝麻素酚三糖苷从芝麻粕中溶入溶剂的过程已达到动态平衡，继续提高转速只会增加能源消耗。因此，选择转速为400 r/min。

2.2 响应面试验

2.2.1 响应面试验设计与结果

在单因素试验的基础上，采用连续超声提取，以超声功率(X1)、提取液pH(X2)、转速(X3)为考察因素，以芝麻素酚三糖苷得率(Y)为响应值，根据Box-Behnken设计三因素三水平响应面试验，响应面试验因素与水平见表1，响应面试验设计及结果如表2所示。

表1 响应面试验因素与水平

表2 响应面试验设计及结果

2.2.2 响应面回归模型与方差分析

注：*差异显著(p<0.05)；**差异极显著(p<0.01)。

2.2.3 验证试验

利用SAS 9.4 软件对芝麻粕中芝麻素酚三糖苷的提取条件进行优化，得到芝麻素酚三糖苷的最优提取条件为超声功率1 226.29 W、提取液pH 7.73、转速432.19 r/min，此条件下芝麻素酚三糖苷得率的预测值为4.34 mg/g。由于实际操作的可行性，选取超声功率1 220 W、提取液pH 7.7、转速430 r/min、超声波作用方式为连续，进行芝麻素酚三糖苷提取试验，重复3次，平均得率为(4.31±0.03)mg/g，与预测值接近，表明此模型合理有效。说明回归方程可以反映各因素对芝麻素酚三糖苷得率的影响。

彭珍等[16]通过回流法对芝麻粕中芝麻素酚三糖苷的提取工艺进行研究，最终芝麻粕中芝麻素酚三糖苷的得率为0.44 mg/g。本研究利用响应面优化芝麻粕中芝麻素酚三糖苷的提取工艺，得率为(4.31±0.03)mg/g，尽管所采用乙醇体积分数、料液比较高，但溶剂可再回收利用，且具有提取时间短、得率高的优势。因此，超声波辅助提取芝麻粕中芝麻素酚三糖苷的效果较好。

3 结 论

本研究在单因素试验的基础上，利用SAS 9.4软件，根据Box-Behnken 的试验设计原理，利用响应面优化超声波-磁力搅拌协同提取芝麻粕中芝麻素酚三糖苷的工艺条件。通过回归数学模型得到最优工艺条件为: 超声功率1 220 W，提取液pH 7.7，磁力搅拌转速430 r/min，超声波作用方式为连续。在最优工艺条件下，芝麻素酚三糖苷得率为(4.31±0.03) mg/g。