竹叶花椒ZaHMGS基因克隆与表达分析

关淑文, 王 毅, 郝佳波, 原晓龙, 陆 斌, 李贤忠

(1.云南省林业和草原科学院,云南 昆明 650201；2.西南林业大学林学院，云南 昆明 650224)

花椒属芸香科花椒属植物，在世界上约有250种，其中我国占39种，14个变种，我国南北方均有种植[1].花椒果皮是我国重要的食用调料和中药材.因具有独特的香、麻味，且有除腥去膻的功效，被誉为我国的“八大味”之一；据《本草纲目》记载，花椒果皮可消食解郁、止泻杀虫、散寒除湿、补肾温胃等，在我国具有悠久的使用历史[2].常见的花椒种类有红花椒(Zanthoxylumbungeanum)、青花椒(Zanthoxylumschinifolium)和竹叶花椒(Zanthoxylumarmatum)，其中竹叶花椒在总体上香气成分含量最高[3].

竹叶花椒的香味源自于其挥发油，同时挥发油也是评价其品质的主要指标.而挥发油中仅有少部分香气活性成分对其香味具有贡献，其主要包括醇类、酯类和烯萜类.醇类主要有C10H18O，酯类主要有C12H20O2，烯萜类主要有C10H16和C15H24两种.其中C10H16和C15H24分别属于单萜和倍半萜.倍半萜C15H24在竹叶花椒香气成分中存在两个同分异构体，分别是大根香叶烯D和石竹烯，大根香叶烯D的香气特点是花香，而石竹烯的香气特点是丁香和松香[3].而单萜和倍半萜的主要合成途径分别为甲基赤藓醇(2C-methyl-D-erythritol-4-phosphate, MEP/deoxyxylulose 5-phosphate, DXP)途径和甲羟戊酸(mevalonic acid, MVA)途径[4].

羟甲基戊二酰辅酶A合成酶(Hydroxymethylglutaryl-CoA synthase, HMGS)是甲羟戊酸途径的关键酶.首先，乙酰CoA酰基转移酶(AACT)将两分子乙酰CoA(acetyl-CoA)催化形成乙酰乙酰CoA(acetoacetyl-CoA)， 1分子的乙酰CoA再与1分子的乙酰乙酰CoA在HMGS的催化下缩合生成羟甲基戊二酰CoA(HMG-CoA)，其次HMG-CoA经羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(Hydroxymethylglutaryl-CoA reductase, HMGR)的催化生成MVA，此步为MVA途径的限速反应.最后MVA经过甲羟戊酸激酶(MVK)、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)和甲羟戊酸5-焦磷酸脱羧酶(MVD)的焦磷酸化和脱羧作用最终形成C5单位异戊烯基焦磷酸(isopentenyl diphosphate, IPP)，而IPP是形成单萜、倍半萜等萜类化合物的通用前体[5-6].研究显示，MVA途径的代谢通路受HMGS和HMGR共同调节.Ren et al[7]研究表明，在HMGS基因过量表达的灵芝中，三萜类化合物的含量比对照组高出15.1%～24.2%；Schaller et al[8]和Wang et al[9]研究表明，转入橡胶树HMGS基因的番茄和转入芥菜HMGS基因的拟南芥的甾醇含量有所提高[4].绝大部分真核生物都存在甲羟戊酸代谢途径，而作为MVA途径的第2个催化酶，HMGS受到前人较多的研究.研究表明，HMGS存在由2种不同基因编码的线粒体形式和细胞质形式.其中线粒体形式的HMGS目前只在脊椎动物中发现，经其催化作用产生的羟甲基戊二酰CoA是生成酮体的底物[10].

目前，HMGS基因已在茶树[5]、白木香[11]、灵芝[7]、拟南芥[12]、橡胶树[13]、丹参[14]等植物中被克隆得到，但目前尚未见到有从竹叶花椒中克隆得到ZaHMGS基因.本研究对ZaHMGS基因进行克隆与分析，为日后深入探讨羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因功能、倍半萜等萜烯类物质生物合成的分子机理以及利用分子生物学手段选育优良品种提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料

于云南省林业与草原科学院树木园(E102°44′42.57″, N25°08′50.67″)采集竹叶花椒嫁接树和实生树嫩梢上的叶和茎，并且采集实生树大果(6月果)、幼果(5月果)、芽和根(根尖)，用液氮保存带回实验室，放在-80 ℃冰箱中.

HiFiDNA聚合酶、MARK订购于北京全式金生物技术有限公司；引物(ZaHMGS1F、ZaHMGS1R、TZaHMGSF、TZaHMGSR)、Loading Buffer、载体(pUMT)、T4连接酶、感受态细胞(DH5α)、M13Mix订购于生工生物工程(上海)股份有限公司；RNA提取试剂盒(Qiagen)；质粒提取试剂盒(康为世纪)；反转录试剂盒(Takara Super RT试剂盒).

1.2 RNA提取与cDNA合成

将竹叶花椒实生树和嫁接树的各器官：叶、茎、大果、幼果、芽和根分别放到液氮中研磨为粉末后，采用植物RNA提取试剂盒提取竹叶花椒总RNA，其操作按照试剂盒说明书进行，RNA质量检测使用浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳完成，检测RNA浓度则使用NanoDropTM 2000.选择较完整，浓度适宜的RNA，根据制造商的说明，使用反转录试剂盒以1 μg总RNA进行cDNA合成，并置于-20 ℃冰箱中保存备用.其余的RNA置于-80℃冰箱中.

1.3 ZaHMGS基因的克隆

采用克里曼丁桔(Citrusclementina，登录号:XP_006440512.1)的HMGS基因为模板，本地BLAST搜索竹叶花椒的转录组数据，得到竹叶花椒的羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因(ZaHMGS)序列，以该序列为依据,设计特异引物(ZaHMGS1F:5′-ATGGCAAAGAATGTTGGAAT-3′;ZaHMGS1R:5′-TTAGTGACCATTTGCAAGTG-3′).分别用竹叶花椒嫁接树和实生树嫩梢以及实生树的大果、幼果、芽和根的cDNA为模板，ZaHMGS1F和ZaHMGS1R为引物，以HiFiDNA聚合酶进行扩增得到ZaHMGS全基因片段.经过电泳检测后将目的片段连接到pUMT载体上，经PCR检测，送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行基因测序.

1.4 ZaHMGS基因蛋白序列分析

使用NCBI上的ORF Finder分析获得的竹叶花椒羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因(ZaHMGS)的cDNA序列，得到蛋白氨基酸序列，并用ProParam预测其蛋白的理化性质；用SignalP 4.1 server预测该蛋白有无信号肽；通过NCBI对羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因的蛋白氨基酸序列进行序列搜索，选择与ZaHMGS蛋白序列同源性较高的植物羟甲基戊二酰辅酶A合成酶蛋白序列，利用DNAMAN将其与竹叶花椒HMGS蛋白序列进行相似度比对，最后利用MEGA 7.0构建系统进化树.

1.5 基因的转录模式分析

成功合成cDNA第1条链后，以TZaHMGSF(5′-CAAGATTGCATGGCCTTTTG-3′)和TZaHMGSR(5′-TTCTCAAGGAGGTTAGCAAC-3′)作为特异引物，且以ubiquitins(NCBI登录号:MK953729)作为内参基因，经荧光定量PCR检测竹叶花椒ZaHMGS基因在嫁接树的茎和叶以及实生树的茎、叶、大果、幼果、芽和根中的具体表达情况.用SYBR Green(invitrogen)检测特异引物的PCR产物.25 uL反应体系的可选参数如下：2×SYBR绿色主混合物12.5 μL，上下游引物(10 μm·L-1)0.5 μL，模板(cDNA)1 μL，ddH2O 10.5 μL.使用PCR热循环仪(ABI 7300;应用生物系统,Foster City, CA, USA).PCR反应程序：变性程序(95 ℃, 10 min)，放大定量程序重复45次(95 ℃, 15 s; 57 ℃, 10 s; 72 ℃, 15 s;单次荧光测量)，熔化曲线程序(60 ℃至95 ℃, 加热速度0.1 ℃, 连续荧光测量)，最后冷却至40 ℃.以延伸因子1-alpha (EF1a)基因作为基因正常表达的内部调控因子，通过qPCR分析每个样品的至少2个独立的生物学重复和每个生物学重复的3个技术重复，以确保再现性和可靠性.用比较Ct值法计算相对基因表达量f，其中f=2-△△Ct，△△Ct=(试验目标基因组的Ct值-试验组参考基因的Ct值)-(对照组目标基因的Ct值-对照组参考基因的Ct值).

2 结果与分析

2.1 RNA提取和ZaHMGS基因克隆

利用植物总RNA提取试剂盒成功提取竹叶花椒嫁接树和实生树的总RNA后，反转录得到cDNA.以ZaHMGS1F和ZaHMGS1R作为特异引物，成功克隆得到竹叶花椒ZaHMGS基因(图1).经NCBI ORF Finder软件对测序结果进行分析显示ZaHMGS基因具有长1 398 bp的完整的cDNA开放阅读框(ORF)，编码465个氨基酸(NCBI登录号:MK953727).

2.2 竹叶花椒ZaHMGS基因蛋白序列分析

用在线程序NCBI ORF Finder预测ZaHMGS基因的开放阅读框，ProParam预测其蛋白的理化性质.结果表明：该蛋白由465个氨基酸残基组成，其分子量为51 359.42 u，理论等电点pI为5.93；在美国国家生物技术信息中心(NCBI)上对推断得到的ZaHMGS蛋白序列进行比对，发现其与已知功能的甜橙(sweet orange,Citrussinensis)、克里曼丁桔(clementine mandarin,Citrusclementina)、榴莲(durian,Duriozibethinus)和可可(cocoa,Theobromacacao)的HMGS蛋白序列相似性较高，结果为：ZaHMGS蛋白序列与克里曼丁桔的CcHMGS蛋白序列相似性为92.57%；与甜橙的CsHMGS蛋白序列相似性为92.36%；与榴莲的DzHMGS蛋白序列相似性为87.47%，与可可的TcHMGS蛋白序列相似性为87.05%.对竹叶花椒ZaHMGS蛋白序列分析发现，其存在由21个氨基酸组成的活性中心“GNTDIEGVDSTNACYGGTAAL”和5个被颜色标示的参与底物催化的保守氨基酸，其中三角形标示的2个还能影响酶的活性 (图2).

将推导出来的ZaHMGS蛋白序列放在NCBI上进行比对后，可得到其他植物的HMGS蛋白序列，用MEGA 7.0中自带的Cluster W进行蛋白序列多重比对，通过Neighbor-joining算法(自检举1 000次)绘制出竹叶花椒HMGS与其他植物HMGS的进化树(图3).结果显示竹叶花椒ZaHMGS蛋白与番木瓜(papaya,Caricapapaya)、甜橙、克里曼丁桔的HMGS蛋白聚为一类(图3).

2.3 竹叶花椒ZaHMGS基因的转录模式分析

经特异引物TZaHMGS1F和TZaHMGS1R检测反转录得到的竹叶花椒cDNA，得到ZaHMGS基因在嫁接树茎、嫁接树叶、实生树茎和实生树叶中的具体表达情况以及ZaHMGS基因分别在实生树根、茎、芽、幼果和大果中的具体表达情况(图4)，结果显示，ZaHMGS基因在嫁接树叶、嫁接树茎、实生树叶和实生树茎中的表达量无显著性差异；在实生树各器官的表达量从高到低分别为：幼果、芽、根、茎、大果.

3 讨论

研究表明，不同植物存在着不同的HMGS基因拷贝数，不同拷贝之间也可能存在着不同的功能分化，其中只有1个拷贝的植物有杜仲、麻风树、蓖麻等，含有2个拷贝的植物有木薯、橡胶等，而芥菜含有4个拷贝基因[4,13].竹叶花椒ZaHMGS基因是否也存在多个拷贝有待进一步研究.

异戊烯焦磷酸和二甲基丙烯基二磷酸(dimethylallylpyrophosphate, DMAPP)都是萜类物质的通用前体.植物通过MVE途径和MEP/DXP途径合成IPP和DMAPP，其中MVE途径以3个乙酰CoA作为底物，在细胞质中主要合成倍半萜、三萜以及多萜；MEP/DXP途径以丙酮酸(pyruvate)和3-磷酸甘油醛(glyceraldehyde 3-phosphate, G-3-P)作为底物，在质体中主要合成单萜、二萜以及四萜.不同的生物种类和合成产物的亚细胞位置决定了IPP和DMAPP的合成途径.由1分子DMAPP和1分子IPP缩合生成的橙花基焦磷酸(neryl diphosphate, NPP)或牻牛儿基焦磷酸(greanyl diphosphate, GPP)在单萜合酶的催化下可生成不同的单萜，而由1分子DMAPP和2分子IPP缩合生成的法呢基焦磷酸(fanesyl diphosphate, FPP)在倍半萜合酶的催化下生成不同的倍半萜[15].

HMGS是MVA途径的关键酶，HMGS基因表达量的变化可影响萜类的合成[13].从荧光定量PCR结果可以看出，嫁接并不影响ZaHMGS在叶和茎中的表达量，且叶和茎之间的表达量并无显著性差异；而Kai et al[16]对曼地亚红豆杉的研究显示，TmHMGS在针叶和茎中的表达水平相类似，这与本研究结果相一致.ZaHMGS在芽和幼果等生长旺盛部位的表达量较高， 而Liu et al[17]研究表明， 植物三七的基因PnHMGS1在花中的表达量比根、茎、叶高.邹智等[18]在对蓖麻的研究中显示，RcHMGS在Ⅱ/Ⅲ期胚乳和花中的表达丰度较Ⅴ/Ⅵ期胚乳、种子和叶高.以此同时，Besser et al[19]研究表明，HMGS和HMGR基因在番茄腺毛细胞中大量表达，并且产生多种次生代谢物，以此抵抗病原体和害虫.萜类物质参与了植物的防御作用，而幼嫩部位相对成熟部位缺少强有力的表皮、胶质层等屏障来抵御外来病原体的浸染，因此推测幼嫩部位相对成熟部位需要更多的萜类物质参与化学防御，而这些萜类物质中，又包含有柠檬烯、α-蒎烯、γ-萜品烯、β-石竹烯、桧烯等具有香味的成分[3].但是，陈林波等[5]研究表明，茶树ScHMGS基因在成熟叶片中的表达量较嫩叶高.朱畇昊等[20]研究表明，冬凌草组培苗IrHMGS基因在根和叶的表达量较愈伤组织、茎和组培苗花高.结合前人研究结果发现，HMGS基因在不同植物中的表达不同.虽然HMGS表达量的提高可促进萜类合成量的升高，但萜类的合成受合成途径中多种酶的共同调节，Suwanmancee et al[21]研究表明，橡胶产量提高的幅度不如HMGS基因表达量和HMGS酶的活性提高的幅度大.所以植物萜类合成很可能还受到负反馈调节机制的调节作用，ZaHMGS表达量的升高对应萜类合成量提高的幅度还有待进一步研究.

提高植物萜类产量是热门研究课题，近年来人们对萜类代谢途径及其调控机理的研究不断深入，同时青蒿酸和类胡萝卜素代谢工程也取得突破性进展，使得代谢工程逐渐成为提高萜类产量最有潜力的途径之一[22].通过代谢工程提高植物萜类产量的分子调控方法有多种，第一是可提高限速酶的酶活性或表达水平以提高植物萜类产量，如HMGS、HMGR等；第二是阻止代谢通路的中间产物流向竞争路线；第三是阻止反馈调节机制对代谢产物合成的抑制，如使用酶的抑制剂等；第四是减少目的产物的分解[19,23].本研究对竹叶花椒羟甲基戊二酰辅酶A合成酶基因进行克隆与分析，为日后深入研究其在竹叶花椒中受调控的机理及功能提供依据，以便更好地利用代谢工程手段提高竹叶花椒挥发性萜类物质的含量，对提高果皮品质具有重要意义.