巨噬细胞特异性敲除TSC1小鼠的构建

刘小琳，梁康檐

结节性硬化复合物1/2(TSC1/2)复合体是许多细胞功能的关键调节分子的作用点，控制广泛的细胞信号通路[1]。其中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)作为其下游的信号分子受TSC1/2复合体的调控。TSC1/2复合体通过GTPase活化蛋白活性负调控Rheb,而间接地抑制mTOR。mTOR是一种极其保守的丝氨酸 / 苏氨酸激酶，它可以整合各种信号，包括能量、生长因子、营养和应激等，以调节细胞生长、增殖、存活和代谢[2-4]。mTOR已被证明是免疫应答的中心感应器[5-6]。巨噬细胞在炎症的发生中起着关键作用，它是机体对抗炎症的重要武器，而且与临床上多种疾病的发生发展密切相关。近年来，有研究发现TSC1/2复合体是控制巨噬细胞极化的关键调节剂，巨噬细胞的极化状态受TSC-mTOR信号通路的影响，揭示炎性反应调控新机制[7-8]。本研究利用Cre-loxP系统成功构建巨噬细胞特异性敲除TSC1小鼠(LysM-Cre TSC1flox/flox)，为研究TSC1在巨噬细胞极化中的作用提供稳定的动物模型。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 实验动物：LysM-Cre小鼠和TSC1-loxP小鼠均来自南方医科大学细胞生物学实验室。

1.1.2 试剂：p-S6(S235/236)和S6抗体购自Cell Signaling Technology公司，TSC1购自Abcam公司，a-Tubulin抗体购自Abclonal公司，辣根过氧化酶(HRP)标记的山羊抗鼠、山羊抗兔和化学发光试剂盒均购自Santa Cruz公司，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其他常用试剂为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 LysM-Cre TSC1flox/flox小鼠模型建立:首先利用LysM-Cre 小鼠与TSC1flox/flox小鼠交配，产生同时携带杂合TSC1 loxP位点和LysM-Cre的第一代小鼠(LysM-Cre TSC1flox/+)，将产生的这种小鼠再与纯合的TSC1flox/flox小鼠回交，以获得同时携带纯合TSC1 loxP位点和LysM-Cre的小鼠(Lysm-Cre TSC1flox/flox)。我们使用LysM-Cre TSC1flox/flox小鼠和TSC1flox/flox小鼠分别作为巨噬细胞特异性敲除TSC1小鼠和对照小鼠，分别命名为KO小鼠和WT小鼠。

1.2.2 LysM-Cre TSC1flox/flox小鼠模型鉴定：取4周龄左右KO小鼠和WT小鼠，剪取鼠尾，加入200 μl鼠尾裂解液，置于55 ℃水浴过夜反应。裂解反应完成后，100 ℃下煮沸10 min，灭活蛋白酶K，室温下6 000 rpm离心5 min，上清液即为DNA模板。基因型鉴定引物序列，见表1。

表1 基因型鉴定引物序列

1.2.3 敲除效果验证：分别取KO小鼠和WT小鼠腹腔白色脂肪组织，提取蛋白，电泳分离，分离后将蛋白转到硝酸纤维膜上后用相应的抗体[TSC1、p-S6(S235/236)、S6、Tubulin]杂交，用ECL发光试剂显色曝光，即用蛋白免疫印迹方法(Western-blot)检测TSC1、p-S6(S235/236)、S6的表达情况。

2 结果

为研究TSC1在巨噬细胞中的作用，我们成功建立了LysM-Cre TSC1flox/flox小鼠模型。通过PCR产物鉴定，LysM-Cre的PCR产物条带为700 bp，TSC1-loxP条带分别为230 bp和193 bp，分别对应纯合和野生的两种基因型(图1，目录后)。Western-blot结果显示TSC1在巨噬细胞中被敲除。与对照组小鼠相比，KO小鼠中TSC1条带十分微弱，蛋白表达量明显下降，mTOR下游直接靶标p-S6(S235/236)条带十分明显，蛋白表达量明显升高(图2，目录后)。

3 讨论

巨噬细胞在炎症的发生中起着关键作用，它是机体对抗炎症的重要武器，而且与临床上多种疾病的发生发展密切相关[9]。巨噬细胞通过响应其局部细胞因子环境，活化成促炎表型(M1)或抗炎表型(M2)，从而引发对病原体的炎症反应并修复受损组织[10-11]。有研究表明，TSC1/2复合体通过不同的信号通路来调控巨噬细胞的极化状态，从而调控巨噬细胞的内稳态，抑制巨噬细胞的炎性反应，避免自发炎性疾病的发生，为临床治疗巨噬细胞相关免疫性疾病的防治提供了新思路[7]。

基因敲除技术在基础实验研究中得到了广泛的应用，而条件性基因敲除技术作为新一代基因敲除技术，有着明显的优势和更为广泛的应用前景。其中基于Cre-loxP系统的条件性基因敲除小鼠因其良好的实验效果得到了许多研究的青睐[12]。将携带LysM启动子的Cre小鼠与TSC1-loxP小鼠进行交配，能够在小鼠巨噬细胞中特异性敲除TSC1基因，得到巨噬细胞特异性敲除TSC1小鼠。LysM-Cre是利用Lyz2的启动子构建的转基因小鼠，Lyz2主要在髓系细胞中表达[13]。Clausen等首先建立了这种能在髓系细胞中发挥重组功能的LysM-Cre转基因小鼠[14]。研究发现，利用LysM-Cre小鼠将膜铁转运蛋白1(Ferroportin1)从巨噬细胞中敲除后，小鼠出现轻度贫血和血色素沉着现象[15]。朱琳楠等成功构建了髓系特异性缺失TSC1基因的小鼠(LysM-Cre TSC1flox/flox)，并且发现TSC1与巨噬细胞M1/M2型的极化的相关性[7]。本研究构建的巨噬细胞特异性敲除TSC1小鼠与上述髓系特异性缺失TSC1基因的小鼠结果一致。

本研究中，通过PCR鉴定，TSC1flox/flox基因条带为单一条带，230 bp。Western-blot鉴定，相比于WT小鼠，KO小鼠TSC1的表达微弱，mTOR下游直接靶标p-S6(S235/236)蛋白表达量明显升高，表明巨噬细胞特异性敲除TSC1小鼠(LysM-Cre TSC1flox/flox)构建成功，为进一步研究TSC1在巨噬细胞极化中的作用提供了稳定的动物模型。