超高效液相色谱-串联质谱结合谱库检索快速测定鸡蛋中氯霉素、氟苯尼考和甲砜霉素残留

(宁波市食品检验检测研究院,浙江宁波 315048)

氯霉素(chloramphenicol,CAP)、氟苯尼考(florfenicol,FF)和甲砜霉素(thiamphenicol,TAP)同属酰胺醇类抗生素(图1),具有广谱抗菌性。但氯霉素因其苯环上的硝基基团,对人、畜禽有严重的毒副作用[1-2],尤其对造血功能的损害较大,我国已于2002年全面禁止氯霉素及其盐和酯类药物在食用动物上的使用,美国、欧盟等多个国家也禁止氯霉素在食用动物饲养和治疗过程中使用与添加[3-4]。将氯霉素苯环上的硝基基团用甲磺酸基取代,即为甲砜霉素;而氟苯尼考则为甲砜霉素的衍生物。甲砜霉素和氟苯尼考毒副作用小,具有较好的抗菌活性,且价格相对便宜,是自氯霉素禁用以来我国使用较广泛的抗生素[5-6]。但有研究表明,氟苯尼考和甲砜霉素对动物的免疫系统和胚胎均有一定的毒性作用,同时也具有一定的耐药性,长期使用仍有危害性[7-9]。鸡蛋是人们日常生活中较为常用的食品之一,而蛋鸡在饲养过程中,饲养密度大,容易发生疾病,因此在预防和治疗蛋鸡疾病的过程中,常常滥用抗生素,不遵守休药期要求使用,极易造成鸡蛋中药物残留,损害消费者的健康[10]。我国农业部235号文件中附件明确规定[11],鸡蛋中氯霉素不得检出,产蛋鸡中氟苯尼考不得检出。

图1 氯霉素(A)、氟苯尼考(B)、甲砜霉素(C)的分子结构Fig.1 The molecular structures of chloramphenicol(A),florfenicol(B)and thiamphenicol(C)

目前,我国现行有效的标准体系中,用于检测鸡蛋中氯霉素类抗生素的方法只有一套由山东质量技术监督局2018年颁布的地方标准DB37/T 3118-2018《禽蛋中氯霉素类药物残留量的测定 液相色谱法》[12];国内外研究中,检测鸡蛋中酰胺醇类抗生素的方法主要有液相色谱-质谱法(LC-MS)[13-16]、液相色谱法(LC)[17-19]、气相色谱-质谱法(GC-MS)[20]、气相色谱法(GC)[21]和酶联免疫法(ELISA)[22]等。在检测灵敏度、检测成本、检测速度和样品通道方面,液相色谱法和气相色谱法均无法与酶联免疫法相比;而酶联免疫法虽然具有灵敏度高、测定速度快、成本低等优点,但是由于这三种酰胺醇类抗生素结构相似(图1),往往会存在交叉反应,容易出现假阳性的结果。根据欧盟委员会2002/657/EC决议[23]规定,作为禁用兽药的氯霉素其阳性结果必须经过质谱确证,并且禁用的兽药确证检测方法必须能提供结构方面的信息,且要达到4个确证点,而液相色谱法、气相色谱法和酶联免疫法均满足不了上述要求,因此,酰胺醇类抗生素的确证检测方法主要为液相色谱-质谱法和气相色谱-质谱法。而气相色谱-质谱法一般常需对样品进行繁琐的衍生化处理,液相色谱-质谱法具有高选择性、高灵敏度等特点,无需对样品进行衍生化处理,可同时测定多个目标物,弥补了上述方法的诸多不足,因此,选用液相色谱-质谱法来检测鸡蛋中酰胺醇类抗生素。

超高效液相色谱-三重四级杆/复合线性离子阱质谱(QTrap UPLC-MS/MS)具有多反应监测-信息关联采集-增强子离子扫描(MRM-IDA-EPI)检测模式,能够对未知化合物进行双重定性,大大提高了定性分析的准确度;并且能够利用高选择性和高灵敏度的MRM扫描获得化合物的峰面积信息,对化合物进行定量分析[24-25]。本文旨在建立一套灵敏、可靠的可同时检测鸡蛋中氯霉素、氟苯尼考及甲砜霉素药物残留的超高效液相色谱-质谱分析检测方法,首次结合谱库检索比对,对目标物同时做到定性和定量分析。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

阴性鸡蛋样品(土鸡蛋) 宁波本地超市,约20批次;其他鸡蛋 浙江省范围的市售鸡蛋,约200批次;氯霉素(CAP)、氟苯尼考(FF)、甲砜霉素(TAP) 纯度均大于99%,Dr.Ehrenstorfer公司;氯霉素-D5(CAP-D5) 纯度为99.7%,Bepure公司;乙腈、甲醇、乙酸乙酯 色谱纯,德国Merck公司;氨水、正己烷 分析纯 国药集团化学试剂有限公司;实验用水 超纯水器(美国Millipore公司)制备的超纯水,电阻率为18.2 MΩ·cm。

Sceix Qtrap 5500液质联用仪 美国Sceix AB公司;TGL-20M高速台式冷冻离心机 上海卢湘仪离心机仪器有限公司;Vortex 3自动漩涡混合器 德国IKA公司;多功能全自动氮吹浓缩仪 Bioyage Sweden AB。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制 分别称取适量的氯霉素、氟苯尼考和甲砜霉素标准物质,用甲醇溶解,配制成10 μg/mL的混合标准储备液;移取适量的氯霉素-D5,用甲醇配制成100 ng/mL的氯霉素-D5标准储备液,-20 ℃条件下保存。

1.2.2 样品前处理 样品去壳后,匀浆,置于分装瓶中,-20 ℃保存备用。称取2.00 g已均质混匀的生鸡蛋于聚丙烯离心管中,加入适量氯霉素-D5内标和15 mL乙腈后,涡旋混匀5 min,4000 r/min常温离心5 min后,取上清液于另一个聚丙烯离心管中,样品残渣中再加入15 mL乙腈,重复提取一次,合并上清液。40 ℃水浴中氮吹至干。准确加入3.00 mL水复溶后,加5 mL正己烷,涡旋混匀1 min,3000 r/min常温离心1 min,取下清液,过0.22 μm滤膜(尼龙66),供液质联用仪上机。

1.2.3 仪器条件 色谱柱:Phenomenex Kinetex F5色谱柱(100 mm×3.0 mm,2.6 μm);柱温:40 ℃;流动相:A相为水,B相为乙腈;流速:0.2 mL/min;洗脱梯度程序:0～0.50 min,80%A;0.50～7.00 min,80% A～20% A;7.00～7.01 min,20% A～80% A;7.01～8.00 min,80% A,进样量为5 μL。

离子源:电喷雾电离(ESI),负离子模式;检测方式:MRM-IDA(信息依懒性扫描)-EPI(增强子离子扫描)检测模式;电喷雾电压(IS):-4500 V;离子源温度(TEM):500.0 ℃;气帘气(CUR):0.27 MPa;辅助气1:0.34 MPa;辅助气2:0.34 MPa。碰撞气:MRM模式-Medium,EPI(增强子离子扫描)模式-High。氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素的采集参数见表1。当MRM信号大于IDA设定阈值400 cps时,启动线性离子肼的EPI功能,EPI扫描范围:100～400 Da,扫描速率:10000 Da/s,离子阱扫描步长:0.12 Da。

1.2.4 谱库的构建及阳性样品的确证 用蠕动泵连续进样的方式,以7 μL/min的流速将3种浓度为0.6 mg/L的目标化合物的标准溶液注入ESI离子源中,在负离子检测方式下进行一级质谱扫描(Q1 SCAN),得到目标化合物母离子;接着在产物离子扫描(Product Ion MS2)的状态模式下,对目标化合物母离子进行子离子扫描,得到相应的子离子信息;最后在MRM的状态模式下,优化去簇电压(DP)和碰撞电压(CE),具体数据见表1。

表1 氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素保留时间及其质谱参数Table 1 Retention time and MS parameters of chloramphenicol,florfenicol and thiamphenicol

本试验采用MRM-IDA-EPI-谱库检索的模式,利用QTRAP的线性离子阱功能,对目标化合物同时进行定性及定量分析。首先,分别用25、40、55 V这三种碰撞能量对氯霉素、氟苯尼考和甲砜霉素进行EPI扫描,编写这三种物质的LC-MS/MS谱库,包括化学名、分子式、分子量、CAS编号等信息;接着对阳性样品进行MRM-IDA-EPI-谱库检索,在MRM获得化合物的保留时间、峰高、峰面积、离子比率等信息的同时,通过EPI扫描获得一张二级质谱图,使用已经建立好的谱库进行检索匹配;最后通过fit值(匹配值)、revfit值(反匹配值)和purity值(纯度值)的评分综合对阳性样品确证,若purity值在60%以上,两者的相似度较为可信。

1.3 数据处理

采用Analyst及MuliQuantTM软件进行分析,采用Origin 8.0作图。

2 结果与分析

2.1 前处理条件优化

鸡蛋基质复杂,蛋白质、脂类物质含量较高,在进行前处理时,需要消除这些杂质对目标物的干扰。因此本文将从提取条件、净化条件和复溶条件这三个方面进行前处理优化。

2.1.1 提取条件(提取剂)的优化 根据目标物特性及相关文献[26-28],选取比较了氨水含量分别为0、1%、3%、5%、10%(体积分数)的乙腈、乙酸乙酯和甲醇的提取效果(见图2)。结果显示,用甲醇及其碱化物作为提取剂时,提取液浑浊、过滤膜困难、回收率不理想,可能是因为甲醇提取出了较多杂质,且杂质不易离心去除,基质抑制效应使得回收率不佳;用乙腈、乙酸乙酯及其碱化物作为提取液时,提取液较澄清,过滤膜轻松,且乙腈回收率最理想,三种目标物均达到了92%以上,可能是因为乙腈不仅是良好的提取剂,而且还是良好的蛋白质沉淀剂,很好地解决了对鸡蛋中蛋白质的沉淀及对目标物提取的问题。如图2所示,氨水的含量对乙腈、乙酸乙酯和甲醇没有显著区别,因此在实验中不考虑加氨水,进一步比较乙腈、乙酸乙酯和甲醇的提取效果,最终确定选取了乙腈作为提取剂。

图2 不同提取剂对目标物回收率的影响Fig.2 Effect of different extraction solvents on the recoveries of the target compounds

2.1.2 净化条件的优化 有机溶剂对鸡蛋提取时,会有大量脂质及类脂物质被提取出来,因此,净化过程中需除去这类脂溶性杂质。正己烷是常用的去脂溶剂,比较了提取时加15 mL乙腈饱和正己烷(与提取剂同体积)去脂、复溶时加5 mL正己烷去脂这两种净化方法的效果,结果显示,两种净化方法的回收率相似,均在95%～100%之间,因此,从环保、高效的角度考虑,选用复溶时加5 mL正己烷的方法来达到净化效果。

2.1.3 复溶条件的优化 考虑到复溶液与流动相相似原则[10,13],分别选取了水、20%乙腈水溶液(初始流动相)和乙腈这三种复溶液,复溶体积分别选用1.00、2.00、3.00、4.00 mL,考察这三种复溶液和这四种复溶体积对目标物的回收率(图3、图4)、峰形效果以及检出限的影响。结果显示,当水作为复溶液时,回收率均在91%～119%之间,符合GB/T 27404-2008[29]中对于回收率的要求,同时峰形效果最佳;而20%乙腈水溶液和乙腈作为复溶液时,回收率偏高,在104%～140%之间,不符合GB/T 27404-2008中对于回收率的要求,同时峰形较宽,可能是因为当水作为复溶液溶解目标物时,减少了对其他脂溶性物质和蛋白质的溶解,减轻了杂质的基质干扰。当复溶体积为3.00和4.00 mL时,回收率较为理想,可能是因为当复溶体积大时,鸡蛋的基质效应得到了进一步的缓解;虽然当复溶体积为4.00 mL时的效果也较为理想,但考虑到仪器灵敏度的原因,最终选择3.00 mL的水作为复溶液。

图3 不同复溶液对目标物回收率的影响Fig.3 Effect of different dissolved solvents on the recoveries of the target compounds

图4 不同复溶体积对目标物回收率的影响Fig.4 Effect of different volume of dissolved solvents on the recoveries of the target compounds

2.2 仪器条件优化

2.2.1 色谱条件优化 试验采用Phenomenex Kinetex F5色谱柱(100 mm×3.0 mm,2.6 μm)对氯霉素、氟苯尼考和甲砜霉素进行分离,通过流动相梯度洗脱,得到了较好的分离效果,三种目标化合物在8 min内即可完成有效分离。同时还比较了不同流动相对氯霉素、氟苯尼考和甲砜霉素分离度、灵敏度及峰形的影响。如图5所示,水相的酸碱度对于分离度及灵敏度无明显影响;当用乙腈作为有机相时氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考峰形更好,且负离子模式下常选用乙腈作为有机相。因此采用水-乙腈作为流动相体系。采用上述优化后的实验条件,分析了阴性加标样品(鸡蛋),可见,目标化合物分离度好,未受样品基质的干扰。

图5 阴性加标鸡蛋样品(0.5 μg/kg)中氯霉素、氟苯尼考和甲砜霉素的重构离子色谱图Fig.5 Reconstituted ion chromatograms of chloramphenicol,florfenicol and thiamphenicol in spiked sample(0.5 μg/kg)注:A、B、C为氯霉素;D、E为氟苯尼考;F、G为甲砜霉素。

2.2.2 谱库检索与应用 以氟苯尼考为例,对可疑阳性样品(鸡蛋)进行谱库比对(见图6),结果显示,Fit值、Revfit值和Purity值分别为80.637%、78.227%、66.793%,其中,Purity值大于60%,因此可疑样品中氟苯尼考阳性。

图6 氟苯尼考的EPI图 Fig.6 EPI mass spectrogram of florfenicol注:A为可疑阳性样品;B为标准品。

2.3 线性方程、相关系数及检出限

为减少基质对定量测定的影响[30],定量用的标准曲线采用基质标准工作溶液配制标准工作曲线。在阴性组织提取液(鸡蛋)中依次添加不同浓度的氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素这三种目标物的标准工作液,分别得到0.03、0.06、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00、50.00 μg/L和0.06、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00、50.00 μg/L这两组不同浓度的标准液。氯霉素以目标物的峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标(y),对应的质量浓度与内标质量浓度的比值为横坐标(x);氟苯尼考、甲砜霉素以目标物的峰面积为纵坐标(y),对应的质量浓度(μg/L)为横坐标(x),分别做线性回归,求得线性回归方程和相关系数(r),氯霉素内标法定量,氟苯尼考、甲砜霉素外标法定量。在最低添加水平下,以3倍信噪比结合浓度外推法确定方法检出限。结果显示,氯霉素和氟苯尼考在0.03～50.0 μg/L,甲砜霉素在0.06～50.0 μg/L的线性范围内线性关系良好,相关系数r>0.999,检出限为0.05～0.10 μg/kg(见表2)。

表2 氯霉素、氟苯尼考和甲砜霉素的线性回归方程、相关系数、检出限Table 2 Linear ranges,linear equations,correlation coefficients(r),limits of detection of chloramphenicol,florfenicol and thiamphenicol

2.4 回收率和精密度

参照GB/T 27404-2008中的要求,对阴性样品(鸡蛋)进行3个水平,每个水平6个平行的加标回收试验。结果表明,氯霉素、氟苯尼考和甲砜霉素在3个加标水平下,平均回收率为90.1%～120.0%,精密度为4.2%～11.9%(见表3)。

表3 鸡蛋样品中氯霉素、氟苯尼考和甲砜霉素的加标回收率和精密度(n=6)Table 3 Spiked recoveries and RSDs of chloramphenicol,florfenicol and thiamphenicol in eggs(n=6)

2.5 实际样品检测

依照本文的研究方法对浙江省市售的200批鸡蛋样品进行检测,检测结果表明(表4),200批鸡蛋样品中氯霉素和甲砜霉素均未检出,有4批样品中检测出氟苯尼考,检出率为2.00%,含量在0.5 μg/kg及以上,说明氟苯尼考在产蛋鸡中有违规使用的现象,但是含量相对较低。

表4 市售鸡蛋中4批样品的检测结果Table 4 Contents of four eggs on sale

3 结论

本文采用乙腈提取、正己烷脱脂的方法对鸡蛋样品进行前处理,建立了鸡蛋样品中酰胺醇类抗生素的超高效液相色谱-串联质谱结合谱库检索的快速检测确证方法。该方法简便、高效、灵敏,能对酰胺醇类药物定量的同时,又可以双重定性,大大提高了检测的准确性,可用于实际鸡蛋样品检测。