柱前衍生化超高效液相色谱-串联质谱法检测水体中代森锰锌残留量

杨 松，柏 杨，王文利，许乐园，高 云，王 苓，邹 楠，慕 卫*,

(1.山东农业大学植物保护学院，山东泰安 271018; 2.山东农业大学农药环境毒理研究中心，山东泰安 271018)

代森锰锌(Mancozeb)是乙撑双二硫代氨基酸甲酸锰和锌离子的配位化合物，它是一种非内吸性广谱保护性杀菌剂，广泛用于防治蔬菜和果树等作物的叶部真菌病害[1]。但该杀菌剂的主要杂质和分解产物乙撑硫脲(ETU)具有致癌、致畸、致突变作用，因此其残留问题受到广泛关注[2]。水环境是与人类接触较为密切的环境介质，具有较强的污染物迁移能力[3]。水体中痕量代森锰锌残留检测对灵敏度要求极高，然而目前水体中代森锰锌残留检测方法过程繁琐，灵敏度较低。因此，建立一种灵敏、准确检测水体中痕量代森锰锌的分析方法很有必要。

目前，有关代森锰锌的残留分析已有很多报道，常见的检测方法有气相色谱法(GC)[4,5]、气相色谱-质谱法(GC-MS)[6]、高效液相色谱法(HPLC)[7]和高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)[8]等。GC和GC-MS法是基于Keppel在1969年提出的二硫代氨基甲酸酯酸水解法[9]，测出的是所有化合物产生的总量，以CS2的检测量计算，该方法目前应用较多，但其稳定性和灵敏度较差。HPLC和HPLC-MS/MS法则采用碘甲烷对代森锰锌进行柱前甲基化，测定其衍生产物亚乙基-1,2-双二硫代氨基甲酸甲酯。由于该衍生产物稳定性好，所以此类检测方法的稳定性和重复性相对较好，应用也相对较多[10]。

水体中痕量农药残留检测的前处理方法一般采用固相萃取(SPE)。固相萃取具有高效、简便、快速、安全、重复性好、多倍富集和便于前处理自动化等优点[11]。Cleanrt©-PEP固相萃取柱表面同时具有亲水性和憎水性基团，可广泛应用于各种化合物的提取、富集和净化。本研究以Cleanrt©-PEP固相萃取柱进行富集浓缩和净化，建立了柱前衍生化的SPE-UPLC-MS/MS法检测水体中痕量代森锰锌残留。方法具有操作简单、灵敏度高，稳定性和重复性好等优点，为水体中代森锰锌残留量的检测提供技术支撑。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

Waters ACQUITY UPLC-H-Class Xevo-TQS Micor超高效液相色谱-串联质谱仪(美国，Waters公司)，配有电喷雾离子源(ESI)；YP20002天平(上海光正医疗仪器有限公司)；瓶口分液器(5～50 mL，德国Dispensette)；SC-3612离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)；Cleanrt©-PEP和Cleanrt©-S C18固相萃取柱(博纳艾洁尔科技有限公司)；YGC-8真空固相萃取仪(郑州宝晶电子科技有限公司)。

代森锰锌标准品(98%，中国标准物质中心)；碘甲烷(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；硫酸二甲酯(上海吉至生化科技有限公司)；NaCl(分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司)；无水MgSO4(分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司)；乙腈、甲酸和甲醇(色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)；EDTA-2Na、NaOH(分析纯，上海国药集团)；L-半胱氨酸(分析纯，天津市科密欧试剂有限公司)；高温蒸馏水(广州屈臣氏食品饮料有限公司)。

1.2 标准溶液配制

称取67.2 g EDTA-2Na，24.3 g L-半胱氨酸和32 g NaOH，用2 000 mL水溶解定容得到溶液A(pH=9.6～10)。准确称取一定量代森锰锌标准品，用溶液A定容得到500 mg/L的标准母液，然后再分别稀释得到10、20、50、100、500、1 000 ng/L系列标准溶液，待衍生化处理。

1.3 样品衍生化及净化

准确量取300 mL待测样品于500 mL的具塞三角瓶中，加入13.4 g EDTA-2Na，7.3 g L-半胱氨酸，6.4 g NaOH和0.6 mL碘甲烷，室温下于摇床上振荡20 min后静置5 min，然后采用真空固相萃取仪以2 mL/min过Cleanrt©-PEP固相萃取小柱，再以6 mL乙腈洗脱，收集洗脱液过0.22 μm有机滤膜，待检测。

1.4 分析条件

液相色谱条件：ACQUITY UPLCTM BEH C18色谱柱(50 mm×2.1 mm 1.7 μm；美国，Waters公司)；流动相A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈；梯度洗脱：0～2 min，90%～2%A；2～3 min，2%A；3～3.01 min，2%～90%A；3.01～4.5 min，90%A。流速：0.35 mL/min；柱温：35 ℃；进样体积：2 μL；总运行时间4.5 min。

质谱条件：毛细管电压3.0 kV；脱溶剂温度550 ℃；离子源温度150 ℃；脱溶剂气流速1 000 L/h；锥孔反吹气30 L/h。离子扫描模式为ESI+，以多反应监测(MRM)模式检测。亚乙基-1,2-双二硫代氨基甲酸甲酯的MRM参数见表1。

表1 亚乙基-1,2-双二硫代氨基甲酸甲酯MRM采集参数

2 结果与讨论

2.1 色谱及质谱条件优化

甲酸是ESI+模式下增强被测物质[M+H]+离子化程度的常用试剂，同时也能使峰形更加的尖锐和对称[12]。本文选用0.1%甲酸水溶液和乙腈作为流动相，优化梯度洗脱条件得到MRM模式下亚乙基-1,2-双二硫代氨基甲酸甲酯的色谱图(图1)，可在4.5 min内将目标化合物分离检测。

图1 亚乙基-1,2-双二硫代氨基甲酸甲酯MRM色谱图Fig 1 MRM chromatogram of mancozeb-dimethyl

2.2 衍生试剂的选择及用量

目前对代森锰锌的检测，一种是以二硫代氨基甲酸酯酸水解法测出的是所有化合物产生的CS2，以其检测量计算，该方法目前应用较多，但其稳定性和灵敏度较差[13]；另一方向是以碘甲烷和硫酸二甲酯作为生化试剂进行甲酯化测定其衍生物亚乙基-1,2-双二硫代氨基甲酸甲酯[14]。本文对碘甲烷和硫酸二甲酯衍生试剂进行优化选择，固定L-半胱氨酸和EDTA-2Na的使用量，代森锰锌与EDTA-2Na进行络合反应转化生成代森钠，代森钠再与衍生试剂发生甲基化反应，得到甲基化衍生产物亚乙基-1,2-双二硫代氨基甲酸甲酯。以1 000 ng/L的代森锰锌标样中加入0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL和1 mL 不同体积的碘甲烷和硫酸二甲酯进行衍生化，然后经UPLC-MS/MS检测，比较衍生产物的峰面积。由图2可知，硫酸二甲酯在添加体积为0.4 mL时衍生产物的峰面积最大，用量继续增大峰面积变化不大。碘甲烷在添加体积为0.6 mL时衍生产物的峰面积达到最大。因此，本研究选用碘甲烷作为衍生化试剂，并确定其使用量为0.6 mL。

图2 不同添加量碘甲烷(a)和硫酸二甲酯(b)下衍生产物的峰面积Fig.2 Peak area of derivative products with iodomethane(a) and dimethyl sulfate(b)

2.3 L-半胱氨酸用量

L-半胱氨酸是一种具有生理功能的氨基酸，它是组成蛋白质的20多种氨基酸中惟一具有还原性基团-SH的氨基酸，试验条件比较温和[15]。代森锰锌在碱性条件下易发生分解，需要加入一定量的抗氧化剂L-半胱氨酸来避免分解。固定碘甲烷和EDTA-2Na的使用量，在L-半胱氨酸浓度50 mmoL/L、100 mmoL/L、150 mmoL/L、200 mmoL/L、250 mmoL/L和300 mmoL/L时比较衍生产物的峰面积(图3)。结果表明，随着L-半胱氨酸浓度的增加衍生产物的峰面积逐渐增加，在浓度200 mmoL/L时衍生产物的峰面积最大，因此确定L-半胱氨酸的浓度为200 mmoL/L。

图3 不同浓度L-半胱氨酸下衍生产物的峰面积Fig.3 Peak area of derivative products at different concentrations of L-cysteine

2.4 固相萃取柱的选择

以添加水平为1 000 ng/L，以上样速度为2 mL/min过柱，考察了2种不同吸附类型的固相萃取柱Cleanrt©-PEP和Cleanrt©-S C18的富集浓缩效果。分别采用4、5、6、8和10 mL乙腈进行洗脱，以单点校正方式定量分析，考察回收率情况(图4)。结果表明，在4～10 mL洗脱液下，Cleanrt©-PEP固相萃取柱的平均回收率在60.2%～98.9%之间，当洗脱液为6 mL时回收率达到峰值，再增加洗脱体积回收率变化不大；Cleanrt©-S C18固相萃取柱的平均回收率在64.7%～67.8%之间，回收率偏低。Cleanrt©-PEP柱的填料为官能化聚丙乙烯/二乙烯苯，表面同时具有亲水性和憎水性集团，对各类极性和非极性化合物具有较均衡的萃取效果，本研究选用Cleanrt©-PEP柱进行固相萃取，并确定洗脱液的体积为6 mL。

图4 不同洗脱体积Cleanrt©-PEP和Cleanrt©-S C18固相萃取柱的回收率Fig.4 Recovery of Cleanrt©-PEP and Cleanrt©-S C18 solid phase extraction columns at different elution volumes

2.5 标准曲线和定量限

以代森锰锌标准溶液浓度为横坐标(x)，其对应的峰面积为纵坐标(y)绘制标准曲线。结果见表2：代森锰锌在10～1 000 ng/L浓度范围内线性关系良好，相关系数R2=0.9991。以添加回收最低浓度10 ng/L作为定量限(LOQ)。王珺[16]报道的气相色谱-电子捕获法测定环境水样中的代森锰锌，方法检出限为125 mg/L。本研究与其相比灵敏度大幅度提高，能满足水体中超痕量代森锰锌检测。

表2 代森锰锌的线性方程、线性范围、相关系数(R2)和定量限

2.6 准确度和精密度

以LOQ作为添加回收最低浓度，欧洲共同体理事会官方公报指令中规定农药在水体中的最大残留限量(MRL)值为100 ng/L[17]，以100 ng/L为添加回收中间浓度，选择10倍MRL值作为添加回收最高浓度。分别向空白地表水水样中添加10 ng/L、100 ng/L和1 000 ng/L三个浓度水平，每个添加水平重复处理5次，计算平均添加回收率和相对标准偏差(RSDs%)(表3)。结果表明：代森锰锌在水体中平均添加回收率在79.2%～101.5%之间，RSDs在2.1%～6.9%之间，符合农药残留检测规定要求[18]。

表3 代森锰锌在地表水中的添加回收率和相对标准偏差

2.7 实际样品的检测

采集泰安周边地区7条河流和3座水库水样，编号分别为SXH、PH、NH、WH、QLH、MTH、SLH和DHSK、HQSK、SLSK。WH和SLSK采集位点水样检测出代森锰锌，浓度分别为22 ng/L和36 ng/L且低于欧盟残留限量标准，其他采集位点均未检出。WH和SLSK采集位点水样检出痕量代森锰锌残留，判断该采集位点于乡镇周围，附近紧邻蔬菜基地和果园，是由于当地农民施药造成的。

3 结论

建立了柱前衍生化的SPE-UPLC-MS/MS检测水体中痕量代森锰锌残留的分析方法，并优化选择衍生试剂及其用量。该方法具有操作简便、净化效果好、回收率高、稳定性好、实用性强和灵敏度高等优点，适用于水体中代森锰锌残留的检测，可为水体中EBDCs类农药残留检测提供重要借鉴。