江苏韩信草HPLC指纹图谱及其芹菜素含量测定

禹晓梅,段 琼

(1.江苏省徐州医药高等职业学校,江苏徐州 221116；2.中国矿业大学化学化工学院,江苏徐州 221008)

韩信草（Scutellaria indica L.）为唇形科黄芩属多年生草本植物，分布于我国江苏、浙江、福建、湖南、云南等地，全草可入药，作为我国地方传统药材一直被广泛使用。其性味辛、苦、寒，具有止血消肿、清热解毒、活血止痛等作用，可用于治疗跌打损伤、肝热烦躁、肺热喘咳、毒蛇咬伤等（林建化和陈剑，2012 ；黄蘅和陈学松，2010 ；南京中医药大学，2006）。现代研究证明，韩信草中主要活性成分为黄酮类化合物，具有抗病毒、抗肿瘤的作用，具有很大的临床应用价值（商国懋和邓玉娟，2015 ；潘伟东等，2015）。民间亦常用韩信草为畜类活血行瘀、消炎镇痛。有关专家认为，由于中药既可预防和治疗疾病，促进动物生长，又不会产生危害人体健康的药物残留，我国传统的中医中药已逐步受到广大兽药生产企业和畜禽养殖者的重视，将在很大程度上逐步取代化学药品（葛伟三和赵国敏，2018）。但目前韩信草并未收录载入《中国药典》，对其质量控制没有统一标准，关于韩信草的相关文献报道较少，多是性状鉴别、化学成分分离鉴别、含量测定等，质量控制比较薄弱（赵野等，2018 ；王领弟等，2017 ；梁现蕊和赵萃，2016 ；王玉宝，2014）。

据报道，不同产地中药材化学成分组成及含量存在一定差异，中药指纹图谱能全面反映中药材的整体性化学表征，对中药材的质量控制具有整体性、全面性（刘盼等，2019 ；张依欣等，2019 ；鲁惠玲等，2018 ；谭 鹏 等，2018 ；任波等，2018 ；张 利 等，2017 ；Xu 等，2017 ；Li 等，2016 ；吴娜等，2016 ；刘兴勇等，2015）。为保证韩信草药材临床用药质量，本文采用HPLC 法对江苏不同产地的10 批韩信草药材进行研究，建立了韩信草中药指纹图谱，同时测定了药材中芹菜素的含量，以期寻找江苏不同产地间韩信草药材的异同，为江苏乃至全国唇形科植物韩信草的质量控制及进一步开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器 Agilent 1200 高效液相色谱仪，美国安捷伦科技（中国）有限公司；电子天平（EL104），梅特勒- 托利多仪器有限公司；中药粉碎机（JP-500C），浙江永康久品工贸有限公司；超声清洗器（AS7240A），天津奥特赛恩斯仪器有限公司；Mili-Q 纯水系统，美国Milipore 公司；移液枪（Research plus），德国艾本德公司。

1.1.2 主要试剂 芹菜素（批号YS202012），安徽合肥博美生物，纯度＞98% ；乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯）、冰醋酸（分析纯），均购自天津市科密欧化学试剂有限公司；10 批韩信草药材来源见表1，由江苏联合职业技术学院徐州医药分院程咏梅教授鉴定为韩信草干燥全草。

表1 10 批韩信草全草药材编号及来源

1.2 色谱条件 色谱柱：Agilent Eclipse XDBC18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相 ：0.5%冰醋酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱，梯度程序见表2；检测波长：275 nm；流速：1.0 mL/min；柱温 ：35℃ ；进样量 ：10 μL。

表2 梯度洗脱程序表

1.3 溶液配制

1.3.1 对照品溶液的制备 精密称取芹菜素对照品适量，置于50 mL 容量瓶中，加乙腈溶液定容，摇匀，得芹菜素对照品储备液（0.7 mg/mL）。

1.3.2 供试品溶液的制备 取各批次干燥韩信草药材全草，粉碎，过80 目。精密称取过筛后的韩信草样品0.5 g 置于具塞锥形瓶中，依次加入60、30 mL 70% 的甲醇溶液，分别超声辅助提取45 min，放冷过滤，合并滤液，水浴蒸至微干，残渣转移至10 mL 容量瓶，用乙腈定容，再用0.45 μm微孔过滤膜过滤，即得。

2 方法与结果

2.1 江苏不同产地韩信草HPLC 指纹图谱的建立

2.1.1 精密度实验 取同一批次韩信草（S05），按照“2.3”项下实验方法制备供试品溶液1 份，按“2.1”项下方法设置仪器色谱条件，连续进样5 次，得到相应色谱图。结果表明，各共有峰的相对保留时间的相对偏差（RSD）在0.10% ～0.28%，共有峰峰面积的相对偏差（RSD）在1.2% ～2.9%，均小于3.0%，表明在该色谱条件下仪器精密度良好。

2.1.2 重复性实验 取同一批次韩信草（S05），按照“2.3”项下实验方法平行制备供试品溶液5份，按照“2.1”项下方法设置仪器色谱条件，分别进样，得到相应色谱图。结果表明，各共有峰的相对保留时间的相对偏差（RSD）在0.14% ～0.35%之间，共有峰峰面积的相对偏差（RSD）在0.50% ～2.1%，均小于3.0%，表明在该实验验条件下，方法重复性良好。

2.1.3 稳定性实验 取同一批次韩信草（S05），按照“2.3”项下方法制备供试品溶液1 份，按照“2.1”项下方法设置色谱仪器，将供试品溶液放置0、2、4、8、12、24、48 h 后分别进样，得到相应色谱图。结果表明，各共有峰的相对保留时间的相对偏差（RSD）在0.21% ～0.48%，共有峰峰面积的相对偏差（RSD）在0.23% ～2.5%，均小于3.0%，表明在该实验条件下供试品溶液48 h 稳定。

2.1.4 韩信草指纹图谱的建立及评价 将10 批韩信草药材按照“2.3”项下实验方法制备供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件设置仪器色参数分别进样，得到相应色谱图。将10 批不同产地的韩信草色谱图积分处理后，采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件对谱图进行分析，采用中位数法生成韩信草的HPLC 指纹图谱及对照指纹图谱，分别见图1、图2。根据10 批韩信草药材的指纹图谱检测结果确定15 个共有峰，通过对照品比对（见图3），指认13 号峰为芹菜素。

2.1.5 指纹谱图相似度评价 将10 批韩信草药材色谱数据进行相似度评价计算，得到其指纹图谱与对照指纹图谱的相似度分别为0.970、0.932、0.968、0.917、0.981、0.956、0.964、0.958、0.929、0.973，相似度均在0.910 以上，表明江苏省内不同产地的韩信草药材各批次之间化学成分及其含量差异不大。

2.2 江苏不同产地韩信草中芹菜素含量的测定

2.2.1 精密度实验 精密吸取同一韩信草供试品溶液（S05），按照“2.1”项下色谱方法设置仪器参数连续进样5 次，得到相应色谱图，计算芹菜素峰面积含量的RSD 为1.42%，表明在该色谱条件下，仪器精密度良好。

2.2.2 重复性实验 取同一批次韩信草（S05），按照“2.3”项下实验方法平行制备供试品溶液5份，按照“2.1”项下方法设置仪器色谱条件分别进样，得到相应色谱图。计算芹菜素峰面积含量的RSD 为0.98%，表明在该实验条件下方法重复性良好。

2.2.3 稳定性实验 取同一批次韩信草（S05），按照“2.3”项下方法制备供试品溶液1 份，按照“2.1”项下方法设置色谱仪器，将供试品溶液放置 0、2、4、8、12、24、48 h 后分别进样，得到相应色谱图。计算芹菜素峰面积含量的RSD 为1.2%，表明在该实验条件下，供试品溶液中芹菜素含量48 h 稳定。

2.2.4 加标回收率实验 精密称取韩信草样品S05（含芹菜素 1.45 mg/g）适量，按照“2.3”项下实验方法平行制备供试品溶液9 份，并将供试品溶液分为3 组，每组分别用移液枪精密加入0.50、1.00、1.20 mL 芹菜素储备液，用乙腈定容至25 mL 容量瓶，摇匀，作为供试品溶液。按照“2.1”项下方法设置仪器色谱条件进样，计算加标回收率及RSD，结果见表3。结果表明，该方法具有良好的回收率。

表3 韩信草中芹菜素加标回收率实验

2.2.5 线性关系与检测限 分别精密移取“2.2”项下芹菜素对照 品溶液 1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL 至 50 mL 容量瓶中，制成每 1 mL分 别 含 芹 菜 素 对 照 14.00、28.00、56.00、84.00、112.0、140.0 μg/mL 的标准系列溶液，按照“2.1”项下色谱条件设置仪器参数分别进样，记录各色谱峰峰面积。以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，得芹菜素线性回归方程：A=8.645C+10.472（r=0.9997）。结果表明，黄芩苷浓度为7.00 ～70.00 μg/mL 时，浓度与峰面积有良好的线性关系。逐级稀释降低对照溶液浓度进行测定，直至信噪比为3 ∶1 得溶液检测限为0.2013 μg/mL。

2.2.6 含量测定结果 取10 批韩信草药材，按照“2.3”项下方法制备韩信草供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件设置仪器参数分别进样，计算各批药材中芹菜素含量，结果见表4。

表4 10 批韩信草药材中芹菜素含量 mg/g

3 讨论

3.1 供试品的制备 本研究比较了不同浓度的甲醇、乙醇提取效果，结果显示，用70% 的甲醇提取更能全面显示韩信草的化学成分，且分离度好；比较了回流提取、索氏提取和超声提取的提取效果，结果显示，得到的供试品色谱图无明显差异，因超声提取较为方便，故选择超声提取；实验同时对超声提取次数及超声时间进行了考察，最终确定以60 、30 mL 70% 甲醇分别提取45 min，合并滤液作为供试品效果最佳。

3.2 HPLC 色谱条件的优化 本研究分别考察了水- 乙腈、水- 甲醇、冰醋酸水溶液- 乙腈、冰醋酸水溶液- 乙醇等流动相体系，经反复优化比较，以0.5%冰醋酸水溶液-乙腈为流动相进行梯度洗脱，分离效果最佳。以芹菜素进样，采用二极管阵列全波长扫面，选择275、280 nm 两个检测波长，经比较发现275 nm 波长下韩信草供试品分离度及峰形更好，基线更平稳，故选择275 nm 作为检测波长。

4 结论

本研究建立了江苏不同产地韩信草指纹图谱，确立了15 个共有峰，相似度均在0.91 以上，同时对江苏不同产地的韩信草有效成分芹菜素进行含量测定，结果表明，10 批韩信草药材中芹菜素的含量均在1.25 ～1.48 mg/g 之间，含量变化幅度不大，说明江苏各产地的韩信草质量较为稳定。所建立的方法灵敏、准确、重复性好，可作为韩信草药材质量控制的重要参考依据，为建立科学的中药、中兽药质量评价标准奠定了基础。