干旱胁迫下“Micro-Tom”番茄酵母双杂交cDNA文库构建和鉴定

许向阳，裴 童，吴泰茹，王子玉，赵婷婷，李景富，杨欢欢，张 贺，姜景彬

（1.东北农业大学园艺园林学院，哈尔滨 150030；2.农业农村部东北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，哈尔滨 150030）

番茄（Solanum lycopersicum）在生长发育过程中面临许多不利环境因素，如非生物胁迫。在非生物胁迫中，干旱胁迫是造成番茄经济损失最严重的胁迫之一，对番茄植株水分代谢途径与干旱逆境应答信号传导途径产生显著影响[1]。例如，干旱胁迫降低番茄叶片气孔开放率，改变生理生化反应，从而影响番茄水分与营养代谢途径[2]。干旱胁迫也可通过打破植物细胞内Na+与K+平衡，导致番茄叶片水分含量发生改变，引起植物代谢紊乱和形态变化[3]。干旱胁迫还可诱导抗旱应答过程中转录因子与基因表达，使其通过脱落酸（ABA）等信号传导途径增强植物对胁迫的抵抗能力[4]。植物对干旱胁迫的响应是一个具有多种级联反应的复杂调控过程，许多转录因子、基因共同调控抗旱应答信号传导途径与生理生化代谢等途径[5-6]。当植物遇到干旱胁迫时，植物体内干旱胁迫应答基因迅速表达以调控该过程，在该胁迫应答基因调控的抗旱应答过程中，许多转录因子和基因共同表达促使植物适应胁迫过程[5]。由此可知，干旱胁迫信号引起胁迫信号传导途径中的多种基因表达，参与调控植物抗旱应答，但应答过程中许多调控理论机制尚不清楚，挖掘和探讨未知机制对研究番茄抗旱调控具有重要理论意义。

酵母双杂交系统是检测蛋白质间是否存在相互作用的一种技术方法[7]。该技术首次由Fields等提出，可直接验证已知蛋白相互作用情况，也可筛选文库中与诱饵蛋白质存在相互作用的新蛋白，确定新蛋白质功能[8]。随酵母双杂交技术发展，该技术已应用于多种蔬菜作物。李颖波等在盐胁迫下构建大麦酵母双杂交cDNA文库[9]。雷海英等构建玉米酵母双杂交cDNA文库[10]。邹禹等构建高盐胁迫下水稻酵母双杂交cDNA文库[11]。许向阳等构建Cf-19介导的抗番茄叶霉病（Cladosporium fulvum）免疫应答酵母双杂交cDNA文库[12]。由此可知，酵母双杂交系统在各类作物非生物胁迫、质量性状与病害等领域应用广泛。

“Micro-Tom”番茄是番茄理论研究最好的模式作物，因此本研究以番茄品种“Micro-Tom”作为构建文库的材料，对其作PEG 6000模拟干旱胁迫，干旱胁迫后0、3与6 h“Micro-Tom”番茄材料等量混合，利用Gateway技术构建干旱胁迫下“Micro-Tom”番茄酵母双杂交cDNA文库，以期为进一步完善干旱胁迫下“Micro-Tom”番茄抗旱理论研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料培养与PEG 6000干旱胁迫处理

“Micro-Tom”番茄材料由东北农业大学园艺园林学院番茄课题组提供，试验材料种植于东北农业大学园艺实验站。2019年6月将“Micro-Tom”番茄种子播种于营养钵内，覆膜保湿，避光培养，温度为20～28℃，5 d左右幼苗破土。去掉覆膜，培养条件为:光照17 h，黑暗7 h，温度25～30℃，湿度70%～75%，避免徒长。待幼苗长至4～5叶一心时将试验材料干旱胁迫处理。干旱处理:将“Micro-Tom”番茄幼苗置于15%PEG 6000溶液中模拟干旱条件。干旱胁迫早期0、3与6 h“Micro-Tom”番茄幼嫩叶片置于液氮中，保存于-80℃冰箱用于干旱胁迫下“Micro-Tom”番茄酵母双杂交cDNA文库构建。

1.2“Micro-Tom”番茄叶片总RNA提取与mRNA分离纯化

将PEG6000胁迫处理后0、3与6 h番茄叶片等量混合，称取1 g样品在液氮下研磨用于干旱胁迫下“Micro-Tom”番茄酵母双杂交cDNA文库构建。将研磨试验材料加入Trizol，震荡后加入CH3Cl离心；弃去多余液体加入异丙醇离心，收集RNA沉淀，于通风处风干，加入适量DEPC水溶解。最终得到干旱胁迫下“Micro-Tom”番茄酵母双杂交cDNA文库总RNA。

按照Oligotex mRNA Midi Kit说明书对干旱胁迫下“Micro-Tom”番茄酵母双杂交cDNA文库总RNA作mRNA分离与纯化。首先向RNA沉淀中加入DEPC水溶解，再向其中加入buffer OBB与Oligotex suspension溶液水浴，离心后获取沉淀。其次，向沉淀中加入OW2与buffer OEB溶液，于凝胶电泳下观察mRNA条带分布情况。最后，mRNA中加入NH4OAC与糖原等物质混匀，无水乙醇清洗两次，最终获得已纯化mRNA沉淀。利用凝胶电泳检测mRNA质量用于构建干旱胁迫下“Micro-Tom”番茄酵母双杂交cDNA文库。

1.3 干旱胁迫下“Micro-Tom”番茄酵母双杂交初级cDNA文库构建

1.3.1 cDNA双链合成

根据Invitrogen公司构建cDNA文库说明书构建干旱胁迫下“Micro-Tom”番茄酵母双杂交cDNA文库。cDNA首链合成试剂:mRNA模板、DEPC水、dNTPs、5×First Strand Buffer与SuperScript III RT酶等。cDNA第2条链合成试剂:DEPC水、E.coliDNA Ligase、E.coliRNaseH、5 X Second Strand Buffer、E.coliDNA Polymerase I、 EDTA、 T4DNA Polymerase与酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)等。

1.3.2 双链cDNA重组接头连接、分级分离与收集

将双链cDNA与三框attB1重组接头连接（3种接头分别各连接1份）。3份cDNA产物混合后加入TEN Buffer分级分离，向分级分离的cDNA产物加入以下成分于-80℃冰箱静止:Glycogen、100%ethano与NH4OAc，静止后室温下离心收集沉淀；加入乙醇溶液（70%）清洗沉淀并吹干，加入DEPC水溶解获得酵母双杂交初级文库cDNA。

1.3.3 cDNA重组反应与扩增

将扩增的cDNA片段重组到pDONR222质粒上得到cDNA-pDONR222重组载体，重组载体电转化到大肠杆菌中，加入液体培养基于摇床中复苏菌体55 min。复苏后用涂布棒涂布到固体LB培养基(抗生素Kanamycine)中用于库容量与文库滴度鉴定，剩余菌体加入甘油储存于-80℃冰箱中，此即为干旱胁迫下“Micro-Tom”番茄酵母双杂交初级cDNA文库菌液。

1.4 干旱胁迫下“Micro-Tom”番茄酵母双杂交次级cDNA文库构建

将初级cDNA文库菌液加入液体培养基摇菌扩增，12～14 h后根据Biospin Plasmid DNA Extraction Kit（博日科技有限公司，杭州）提取重组载体质粒，按照1.3.3重组载体方法将质粒cDNA-pDONR222与次级文库pGADT7DEST质粒上形成cDNA-pDONR222-pGADT7DEST重组载体。重组载体转化大肠杆菌，摇床中复苏菌液55 min，最后于固体培养基（抗生素Ampicillin）上培养菌落。剩余菌液加入等量甘油保存于-80℃冰箱中，即为干旱胁迫下“Micro-Tom”番茄酵母双杂交次级cDNA文库菌液。

1.5 干旱胁迫下“Micro-Tom”番茄酵母双杂交各级cDNA文库质量鉴定

1.5.1 初级、次级与目的cDNA文库库容量检测

将酵母双杂交初级与次级cDNA文库菌液10倍稀释，稀释后从两个文库中各吸取50 μL分别涂布于含Kanamycine与Ampicillin抗性的固体LB培养基上，37℃培养12～16 h长出菌落克隆。

酵母双杂交初级/次级cDNA文库滴度（CFU·mL-1）:平板上全部菌落克隆数量50 μL× 100倍×1×103μL。酵母双杂交文库总容量（CFU）=酵母cDNA文库滴度（CFU·mL-1）× 文库菌液总体积（mL）。番茄目的酵母文库滴度（CFU·mL-1）=平板上克隆数量/涂板菌液体积×文库菌液稀释倍数。

1.5.2 初级、次级与酵母cDNA文库片段长度与重组率鉴定

初级、次级cDNA文库固体LB培养基中分别选取24个单菌落，通过PCR检测cDNA文库中重组序列完整性。其中，初级cDNA文库与次级cDNA文库PCR引物均由Invitrogen公司设计并提供，而PCR反应程序参照文献[13]。最终，“Micro-Tom”番茄初级与次级酵母文库cDNA文库片段长度通过1%琼脂凝胶电泳检测鉴定，观察目的条带数量及其长度。重组率（%）=重组成功数量/全部克隆总数×100%。

1.6 干旱胁迫下“Micro-Tom”番茄酵母双杂交文库构建与质量鉴定

次级cDNA酵母文库菌液在37℃，200 r·min-1摇床中扩繁，14～16 h后采用诺唯赞质粒提取试剂盒提取cDNA-pDONR222-pGADT7DEST重组质粒。将提取的质粒转入酵母中，具体方法如下:将次级cDNA文库质粒与Herring Testes Carrier DNA混合热激与冰浴；加入感受态细胞Appendix B试剂混合水浴离心等；加入3YPD Plus液体培养基复苏酵母2 h；离心后加入生理盐水（0.9%）稀释菌块，将菌液250 μL在SD/Leu培养基上培养，共100个平板，于30℃培养箱中黑暗培养3～4 d可观察到单菌落；将长出菌落平板放置于4℃冰箱冷却约3～4 h，加入冷冻培养基，按照1.5.1方法检测目的酵母cDNA文库库容量与文库滴度，吸取100 μL酵母双杂交cDNA文库菌液按照1∶100、1∶1 000与1∶10 000稀释，均匀涂布在SD/Leu培养基上于30℃培养箱中黑暗培养2～4 d可观察到单菌落生成；随机选择单克隆（24个）置于液体培养基，于30 ℃，250 r·min-1摇菌14～16 h，离心4 min弃上清，加入SDS溶液重悬菌体通过PCR鉴定菌落阳性克隆数量，计算重组率。最终，将PCR产物加入loading Buffer在琼脂糖凝胶电泳中检测干旱胁迫下“Micro-Tom”番茄酵母双杂交cDNA文库重组序列完整性（片段长度与重组率）。

2 结果与分析

2.1 番茄总RNA、mRNA与ds cDNA质量检测

将“Micro-Tom”番茄植株作PEG 6000处理，在胁迫后0、3与6 h选取“Micro-Tom”番茄幼嫩叶片提取干旱胁迫下“Micro-Tom”番茄酵母双杂交cDNA文库总RNA。在1%琼脂糖凝胶下检测cDNA文库总RNA质量，如图1a所示，图谱中总RNA主要有两条带，28S主带与18S次带，两条带清晰且明亮，无明显弥散性条带。由此可知，cDNA文库总RNA质量较好，无降解。mRNA电泳图谱如图1b所示，mRNA条带在500～2 000 bp范围内呈均匀弥散分布，证明cDNA文库mRNA质量较好，未发生降解。ds cDNA电泳图谱如图1c所示，ds cDNA条带在较大范围内呈弥散性均匀分布，因此cDNA条带完整性较高，质量较好，可用于构建干旱胁迫下“Micro-Tom”番茄酵母双杂交cDNA文库。

2.2 初级cDNA文库构建与鉴定

将cDNA初级酵母cDNA文库菌液100倍稀释后于固体LB培养基（含抗生素Kanamycine）上培养，待长出菌落后计数。

如图2a所示，经计算“Micro-Tom”番茄初级cDNA文库平板上共长出1 300个克隆，初级cDNA文库滴度为2.6×106CFU·mL-1，初级cDNA文库库容量为1.04×107CFU。初级cDNA文库培养基中随机选择24个克隆检测，电泳图谱检测结果显示（见图2b），24个克隆全部扩增出条带，重组率为100%，该结果从一定程度上降低克隆假阳性。24个克隆全部为500 bp以上，且插入片段平均长度＞1 000 bp。由此可知，以上数据达到构建干旱胁迫下“Micro-Tom”番茄酵母双杂交cDNA文库标准。

2.3 次级cDNA文库构建与鉴定

将“Micro-Tom”番茄次级酵母cDNA文库菌液按照上述方法100倍稀释后于固体LB培养基（含抗生素Ampicillin）上培养，待长出菌落后计数。如图3a所示，经计算Micro-Tom番茄初级cDNA文库平板上共长出1 700个克隆，次级cDNA文库滴度为3.4×106CFU·mL-1，次级cDNA文库的库容量为1.36×107CFU。利用PCR方法检测次级cDNA文库重组率与插入片段长度，在次级cDNA文库培养基中随机选择24个克隆检测。凝胶电泳图谱检测结果显示（见图3b），24个克隆全部扩增出条带，重组率为10%，该结果从一定程度上降低克隆假阳性。其中，24个克隆全部为500 bp以上，片段最长为2 000 bp，有18个克隆位于1 000～2 000 bp，6个克隆片段长度位于500～1 000 bp，且插入片段平均长度＞1 000 bp。由此可知，以上数据达到构建干旱胁迫下“Micro-Tom”番茄酵母双杂交cDNA文库标准。

2.4 干旱胁迫下Micro-Tom番茄酵母cDNA文库质量鉴定

将次级cDNA文库菌液转化到酵母菌株中于SD/Leu培养基中培养。按100、1 000与10 000倍稀释菌液，最后吸取100 μL稀释度为10 000倍酵母双杂交cDNA文库菌液涂布培养，得到干旱胁迫下“Micro-Tom”番茄酵母双杂交cDNA文库。

由图4a可知，该酵母双杂交cDNA文库平板上共长出600个克隆，文库滴度为6.0×107CFU·mL-1。利用PCR检测番茄cDNA酵母文库重组率与插入片段长度，在目的酵母cDNA文库培养基中随机选择24个克隆检测。

根据图4b凝胶电泳图谱检测结果显示，24个克隆全部扩增出条带，重组率为100%，该结果从一定程度上降低克隆假阳性。其中，24个克隆全部为500 bp以上，16个克隆位于1 000～2000 bp，18个克隆片段长度位于500～1 000 bp，且插入片段平均长度＞1 000 bp。由此可知，以上数据达到构建干旱胁迫下“Micro-Tom”番茄酵母双杂交cDNA文库标准。

3 讨论与结论

酵母双杂交技术是检测蛋白质间是否存在相互作用与筛选酵母cDNA文库中未知功能蛋白的重要手段，对研究新蛋白质功能与代谢途径有重要意义[7]。目前，许多研究者构建酵母双杂交cDNA文库，为更深入研究基因与蛋白作用机理、信号传导与代谢途径奠定基础。酵母双杂交cDNA文库构建方法主要有SMART法与Gateway法，SMART法构建cDNA文库所需RNA含量少，成本较低，仅能采用Mating方法筛选cDNA酵母文库，局限性较大。而Gateway法所需RNA质量较高，通过重组方法提高文库重组率与库容量，可采用Mating方法与共转两种方法筛选cDNA酵母文库[14]。因此，本试验采用Gateway技术构建干旱胁迫下“Micro-Tom”番茄酵母双杂交cDNA文库。

构建高质量cDNA酵母文库有利于高效筛选cDNA文库中蛋白质，酵母双杂交cDNA文库质量主要通过库容量与重组序列完整性两方面判断[15]。库容量是构建cDNA文库中全部克隆的数目，其数量代表cDNA文库覆盖度，1个完整的酵母cDNA文库的文库滴定度需达1.0×106CFU·mL-1以上为合格[16]。本研究初级酵母cDNA文库、次级酵母cDNA文库与“Micro-Tom”番茄酵母双杂交cDNA文库的文库滴定浓度分别是为2.6×106、3.4×106与6.0×107CFU·mL-1。周汐等构建大豆酵母杂交cDNA文库的文库滴度为1.0×107CFU·mL-1[17]。王玉姣等构建辣椒疫霉菌诱导辣椒酵母双杂交cDNA文库的文库滴度为1.13×106CFU·mL-1[18]。由此可知，本研究构建的干旱胁迫下“Micro-Tom”番茄酵母双杂交cDNA文库的库容量达到标准，相比之下该酵母双杂交cDNA文库种类更丰富，覆盖度更完整。

基因重组率与插入基因片段长度代表基因重组序列完整性[19]。其中，cDNA文库平均插入片段需达1 000 bp以上才可达到构建酵母双杂交cDNA文库的标准[20]。重组率是重组载体成功的数目与克隆总数百分比，一定程度上反映文库中菌落假阳性出现概率。本试验初级、次级与“Micro-Tom”番茄酵母cDNA文库平均插入基因片段长度均＞1 000 bp，重组率均为100%，降低该cDNA文库中菌落假阳性概率，以上数据均达到构建cDNA文库要求。刘露露等构建霜霉菌侵染后葡萄叶片酵母双杂交cDNA文库的平均插入片段长度＞1 kb，重组率为96%[14]。邹禹等构建水稻高盐胁迫下酵母双杂交文库平均插入片段长度＞1 kb，文库重组率为96%[11]。本研究构建干旱胁迫下“Micro-Tom”番茄酵母双杂交cDNA文库质量较高。

本研究通过Invitrogen公司Gateway技术完成干旱胁迫下“Micro-Tom”番茄酵母双杂交cDNA文库构建。结果表明，“Micro-Tom”番茄初级cDNA文库与次级cDNA文库的文库滴度分别为为2.6×106与3.4×106CFU·mL-1，文库总库容量分别为1.04×107与1.36×107CFU。干旱胁迫下“Micro-Tom”番茄酵母双杂交cDNA文库滴度为6.0×107CFU·mL-1。初级、次级与“Micro-Tom”番茄酵母cDNA文库重组率均为100%，各级文库插入片段长度大多数均在1 000～2 000 bp，插入片段平均长度均＞1 kb。说明构建cDNA文库质量及完整度较好，可用于筛选互作蛋白文库。