UPLC-MS／MS 法同时测定六味调更片中4 种成分

余 琰 郭 玫*邵 晶 李 娟武权生

［1.甘肃中医药大学，甘肃兰州 730101； 2.甘肃省中药质量与标准研究重点实验室，甘肃兰州 730000；3.甘肃省高校中（藏） 药化学与质量研究省级重点实验室，甘肃兰州730000］

六味调更片由黄芪、当归、女贞子等6 味药材组成，方中黄芪功善补气健脾，为君药；当归补血活血，女贞子滋补肝肾，共为臣药，诸药协同，共奏补肾健脾、补气养血的功效，临床用于治疗妇女围绝经期综合征，疗效确切可靠［1-3］，但其质量标准中只有以HPLC 法测定阿魏酸、黄芪甲苷含有量，而且前者检测采用二极管阵列检测器，后者检测采用蒸发光散射检测器（二极管阵列检测器对其干扰大），同时两者流动相体系不同而不能同时测定，耗时费力。为了提高六味调更片质量以更好地应用于临床，本实验选择君药黄芪中黄芪甲苷、毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷，臣药当归中阿魏酸，女贞子中特女贞苷作为指标，并采用UPLCMS／MS 法同时测定四者含量，以期为更全面控制该制剂质量提供依据。

1 材料

1.1 仪器 UPLC-MS／MS 仪 （液相型号LC-20ADXR，日本岛津公司；质谱型号TRIPLE QUAD 5500，美国AB Sciex 公司）；CAPCELL PAK C18 MGⅢ色谱柱（日本资生堂公司）；AE240 电子天平［十万分之一，梅特勒-托利多仪器（上海） 有限公司］。

1.2 试剂与药物 毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷（批号111920，纯度≥97.6%）、阿魏酸 （批号110773，纯度≥99%）、特女贞苷（批号111926，纯度≥96.3%）、黄芪甲苷 （批号11078，纯度≥96.9%） 对照品均购自中国食品药品检定研究院。乙腈、甲醇为色谱纯，均购自德国默克公司；其他试剂均为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果 参考文献［4-8］报道。

2.1 UPLC 条件 CAPCELL PAK C18MGⅢ色谱柱（2.0 mm×150 mm，5 μm）；流动相0.1% 甲酸（A） -乙腈（B），梯度洗脱（0～2 min，5%～15%B；2～2.5 min，15%～30% B；2.5～3.5 min，30%～50% B；3.5～4 min，50%～70% B；4～8 min，70%～73% B；8～9 min，73%～75% B；9～10 min，75%～95%B；10～12 min，95%～98%B）；体积流量0.3 mL／min；柱温40 ℃；进样量10 μL。

2.2 MS 条件 ESI 电喷雾离子源，正负离子同时监测；电喷雾电压5 500、-4 500 V；离子源温度550 ℃；气帘气30 psi （1 psi ＝0.133 kPa）；碰撞气6 psi；雾化气40 psi；辅助气45 psi。具体参数见表1，提取离子流色谱图见图1。

表1 各成分MS 参数Tab.1 MS parameters for various constituents

图1 各成分提取离子流色谱图Fig.1 Extraction ion current chromatograms of various constituents

2.3 溶液制备

2.3.1 供试品溶液 取片剂适量，研细后过65 目筛，取粉末约0.1 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入25 mL 甲醇，密塞，称定质量，超声（300 W、40 kHz） 处理1 h，放冷，甲醇补足减失的质量，摇匀，0.22 μm 微孔滤膜滤过滤，取续滤液1 mL，甲醇定容至10 mL，即得。

2.3.2 对照品溶液 精密称取各对照品适量，甲醇溶解并定容，得到贮备液（毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、特女贞苷、黄芪甲苷含量分别为0.197 2、0.203 8、0.192 9、0.209 8 mg／mL），取适量置于量瓶中，甲醇定容，即得（四者含有量分别为0.985 8、0.407 7、4.823 6、2.097 9 μg／mL），甲醇逐级稀释成不同质量浓度。

2.4 线性关系考察 精密吸取“2.3.2”项下对照品溶液，在“2.1”“2.2”项条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积平均值为纵坐标（Y） 进行回归，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度试验 精密吸取“2.3.2”项下对照品溶液，在“2.1”“2.2”项条件下进样测定6次，测得毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、特女贞苷、黄芪甲苷峰面积RSD 分别为0.74%、0.57%、1.6%、1.4%，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验 取同一批片剂6 份，按“2.3.1”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”“2.2”项条件下进样测定，测得毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、特女贞苷、黄芪甲苷含有量RSD 分别为1.02%、1.33%、1.18%、1.64%，表明该方法重复性良好。

2.7 稳定性试验 精密吸取同一份供试品溶液，室温下于0、2、4、6、8、10、12、24 h 在“2.1”“2.2”项条件下进样测定，测得毛蕊异黄酮-7-Oβ-D-葡萄糖苷、阿魏酸、特女贞苷、黄芪甲苷峰面积RSD 分别为1.19%、1.68%、1.32%、1.75%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.8 加样回收率试验 取各成分含有量已知的同一批片剂粉末6 份，每份约0.05 g，精密称定，精密加入对照品溶液适量，按“2.3.1”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”“2.2”项条件下进样测定，计算回收率。结果，毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、特女贞苷、黄芪甲苷平均加样回收率分别为98.5%、101.5%、99.4%、98.4%，RSD 分别为2.1%、1.8%、1.1%、1.9%。

2.9 样品含有量测定 取3 批片剂，按“2.3.1”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”“2.2”项条件下进样测定，计算含有量。结果，毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、特女贞苷、黄芪甲苷平均含有量分别为12.23、43.25、208.67、71.69 μg／g。

3 讨论

在样品提取［9-12］时比较了加热回流和超声提取，发现后者可使成分提取完全，而且操作简单。

本实验采用准分子离子／子离子进行分析，发现毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷形成的准分子离子为［M＋H］＋，阿魏酸为［M＋H］＋，特女贞苷为［M-H］-，黄芪甲苷为［M＋Na］＋。子离子是准分子离子经过碰撞诱导解离产生的碎片离子，在碰撞池中中性分子（N2） 的碰撞把能量传递给准分子离子，使其分子键断裂，并与所选择的离子重排形成子离子。由于黄芪甲苷形成的［M＋Na］＋性质特殊，几乎不可能得到稳定的二级碎片离子，故未展示其子离子。再对比了正、负离子模式下各成分的信号响应值，发现特女贞苷在负离子模式时信号响应值高，而其余3 种成分在正离子模式时高，故仅对特女贞苷含有量测定采用负离子模式。

4 结论

本实验建立UPLC-MS／MS 法同时测定六味调更片中毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、女贞苷、黄芪甲苷的含有量，该方法简便、快速、准确，灵敏度高，重复性好，可用于该制剂质量控制，并为其药效物质基础研究提供支持。