大鼠肠道菌群对苦丁茶冬青皂苷D 体外代谢的影响

白春艳，吴三同，张雅琼，顾 雯，张加余，程景平，饶高雄*，车彦云*

（1.云南中医药大学，云南省高校药食同源养生产品工程研究中心，云南昆明 650500； 2.云南中医药大学，昆明市代谢性疾病中医药防治重点实验室，云南昆明 650500； 3.滨州医学院药学院，山东烟台 264003）

苦丁茶冬青是冬青科Aquifoliaceae 冬青属植物苦丁茶冬青Ilex kudingchaC.J.Tseng 嫩叶或叶，味苦、甘，性凉，入肝、肺、胃经，有清暑、解毒、生津的功效［1-2］。苦丁茶冬青皂苷D （kudinoside D） 是苦丁茶冬青中的主要活性成分，在体外显示出抑制3T3-L1 细胞内脂滴形成和脂质沉积的作用，在动物实验中能降低ApoE-／-小鼠主动脉粥样硬化斑块面积大小和胆固醇水平，提示其具有降脂减肥和抗动脉粥样硬化的生物活性［3-4］。

多种天然产物成分口服后，会与胃肠道中的酶或微生物进行接触。尤其是分子量较大的皂苷类口服后，可被肠道菌群代谢，转化为可能比原形成分具有更强生物活性或更好生物利用度的成分［5-6］。因此，研究天然产物成分与肠道菌群的代谢具有重要的意义。本实验采用离体肠道菌孵育的方法，将冬青皂苷D 用大鼠肠道菌的培养液在厌氧条件下温孵，采用UPLC-HR-MSn 技术检测分析其在大鼠肠道菌群中的代谢情况，并推测代谢产物的结构，探讨体外肠道菌群对其代谢转化的一般规律，以期为苦丁茶冬青的体内药效物质基础研究及临床应用开发提供依据。

1 材料

1.1 动物 30 只清洁级健康SD 雄性大鼠，8 周龄，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，生产许可证号SCXK（湘） 2016-01002。

1.2 试剂与药物 苦丁茶冬青叶药材采集自广西大新，经云南中医药大学饶高雄教授鉴定为冬青科植物苦丁茶Ilex kudingcha的干燥叶，其凭证标本保存于云南省高校药食同源养生产品工程研究中心。冬青皂苷D 是课题组从苦丁茶叶70%乙醇提取物中制备得到［3］，经HPLC 归一化法检测，纯度≥98%。厌氧培养基（批号20161207） 购自青岛日水生物技术有限公司；厌氧培养袋（批号20181225）、厌氧产气包（批号20180823） 购自上海哈灵生物科技有限公司。乙腈（美国Fisher Scientific 公司）；甲酸（美国Sigma公司）；其他试剂均为分析纯。

1.3 仪器 Waters Acquity I-Class 超高效液相色谱仪、Waters Xevo G2 QTof 质谱、Acquity UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm× 100 mm，1.7 μm） 购自美国Waters 公司；Synergy UV 型超纯水机（美国Millipore 公司）；恒温培养箱（三洋电机株式会社）；MTN-2800D 氮吹仪（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；SX-500 高压灭菌锅（日本Tomy 公司）；ALLEGRA X-30R 离心机（美国Beckman Coulter 公司）。

2 方法

2.1 色谱条件 Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm× 100 mm，1.7 μm）；流动相水（含0.1%甲酸）（A） -甲醇（含0.1%甲酸） （B），梯度洗脱（0～2 min，10%B；2～6 min，10%～50%B；6～20 min，50%～80%B）；体积流量0.4 mL／min；柱温45 ℃；检测波长226、260 nm；进样量1 μL。

2.2 质谱条件 正离子模式，毛细管电压1 000 V；离子源温度100 ℃；样品锥电压20 eV；雾化气、干燥气氮气（纯度＞99.99%）；碰撞气氦气（纯度＞99.99%）；体积流量10 L／min；扫描模式MSE，质量范围50～1 300 Da；低能量6 eV；高能量30～90 eV。

2.3 对照品溶液制备 精密称取冬青皂苷D 对照品12.8 mg，溶于10 mL 甲醇中，制成1.28 mg／mL，即得，置于4 ℃冰箱中保存备用。

2.4 供试品溶液制备 精密称取冬青皂苷D 对照品39 mg，加入500 μL DMSO 使其完全溶解，再加入无菌水定容至10 mL，放于4 ℃冰箱内保存备用。

2.5 厌氧培养基的配制 称取GAM 肉汤粉末约10 g 于500 mL 烧杯中，加入适量蒸馏水，水浴加热搅拌使其完全溶解，冷却后转移到1 000 mL 容量瓶中，加蒸馏水定容至1 000 mL。将配制好的培养基放置于高压灭菌锅中，0.1 MPa、121 ℃灭菌15 min，灭菌后取出冷却备用［7］。

2.6 大鼠肠道菌群孵育液的制备 SD 大鼠适应性的喂养1周，取其新鲜粪便3.5 g，按1∶4 （质量：体积） 比例加入生理盐水，涡旋，制成混悬液，4 000 r／min离心10 min。取上清液按1∶9 比例加入灭菌培养基混匀，恒温振荡器中厌氧培养24 h （37 ℃、150 r／min），即得［8］。

2.7 苦丁茶冬青皂苷D 在大鼠肠道菌培养液中的代谢 精密量取“2.4”项下的冬青皂苷D 供试品溶液3 mL至离心管中，加入27 mL 雄鼠肠道菌群孵育液，混匀，将溶液分装（每管1 mL），同时设阴性对照组（冬青皂苷D对照品溶液＋厌氧培养液） 和空白对照组（不加冬青皂苷D 的大鼠肠道菌群孵育液），每组重复3 份。将各组装入厌氧袋中密封，于37 ℃恒温培养箱密闭培养0、8、24、48、96 h，取出，加入1 mL 乙酸乙酯-水饱和正丁醇（1∶1）涡旋3 min，10 000 r／min 离心10 min，分别取500 μL 上清液置于1.5 mL 离心管，置于氮吹仪上，37 ℃水浴氮气流吹干。残渣用甲醇溶解定容至1 mL，10 000 r／min 离心10 min，吸取上清液，稀释后进行UPLC-MS 检测。

3 结果

将苦丁茶冬青皂苷D 在大鼠肠道菌培养液中的代谢产物于UPLC-MS 检测，通过分析其中各成分的相对分子质量和保留时间，并结合提取离子流图、各成分质谱信息及相关文献数据进行了代谢产物的结构鉴定。孵育96 h 后的代谢物总离子流图（图1A） 结果显示，冬青皂苷D （M1）主要有4 种体外代谢产物（表1），分别是ilekudinoside P（M2）、kudinoside LZ11（M3）、3-O-α-L-arabinopyranosyl-αku-dinlactone （M4）、α-kudinlactone （M5）。比较不同培养时间样品的代谢物总离子流图（图1B），发现不同代谢时间点的代谢产物种类有差别，如化合物M3 在培养8 h 就可以检测到，M2 和M5 在培养24 h 可以检测到，M4 在培养96 h 后才可以检测到，推测可能是由于单糖苷（M4） 在代谢物中含有量较低的原因。

表1 苦丁茶冬青皂苷D 及其大鼠肠道菌群代谢产物的鉴定分析

3.1 苦丁茶冬青皂苷D 代谢底物和代谢产物鉴别 将正常实验组与空白对照组、阴性对照组进行比较，根据正离子模式MS 及MS／MS 谱图，推测可能的原型成分、代谢产物。从大鼠肠道菌群与苦丁茶冬青皂苷D 的体外培养物中，鉴定出其原型成分和4 个代谢产物。

化合物M1 为苦丁茶冬青皂苷D，在UPLC 中化合物M1 与冬青皂苷D 具有相同的保留时间（11.2 min），在质谱中显示准分子离子［M ＋H］＋为m／z909.49，［M＋Na］＋为m／z931.47，且主要碎片离子峰与标准品一致（图2A）。在正离子模式下，冬青皂苷D 生成的碎片离子主要有m／z747.43、601.38、469.33、451.32、推断它们分别为［M＋H-Glc］＋、［M＋H-Glc-Rha］＋、［M＋H-Glc-Rha-Ara］＋、［M＋H-Glc-Rha-Ara-H2O］＋。

化合物M2 的保留时间是11.65 min （图1 A），在ESIMS 正离子模式（图2B） 中显示m／z785.40 ［M ＋Na］＋、763.34 ［M＋H］＋，与化合物M1 相比失去了146 Da。同时，在质谱图中与化合物M1 显示相同的碎片离子峰m／z601.38、469.32、451.32，推测化合物M2 与M1 具有相同的结构母核，结合分子量和极性，推测它为M1 失去阿拉伯糖基的产物，鉴定为苦丁茶冬青苷P （ilekudinoside P）。

化合物M3 的保留时间是12.07 min （图1A），在ESIMS 正离子模式（图2C） 中显示［M＋Na］＋为m／z769.40，［M＋H］＋为m／z747.41，与化合物M1 比较失去了162 Da。质谱图中显示与化合物M1 相同碎片离子峰m／z601.38、469.33、451.32，推测M3 与其具有相同的结构母核，结合分子量和极性，推测它为M1 失去葡萄糖基的产物，鉴定为苦丁茶冬青皂苷LZ11（kudinoside LZ11）。

化合物M4 的保留时间是12.34 min （图1A），在ESIMS 正离子模式（图2D） 中显示m／z623.42 ［M ＋Na］＋、601.38 ［M＋H］＋，与化合物M1 相比失去了308 Da（图3），与化合物M2 相比失去了162 Da，与化合物M3 相比失去了146 Da。同时，在质谱图中观察到与M1 相同的碎片离子峰m／z451.24，推测它为M1 失去葡萄糖基和阿拉伯糖基的产物，鉴定为3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖基-α-苦丁内酯（3-O-α-L-arabinopyranosyl-α-kudinlactone）。

图1 苦丁茶冬青皂苷D （A）及其代谢物（B） 正离子模式图

化合物M5 的保留时间是13.89 min （图1 A），在ESIMS 正离子模式 （图2E） 中显示491.31 ［M ＋ Na］＋、451.32 ［M＋H］＋，与化合物M1 比较失去了葡萄糖基、鼠李糖基、阿拉伯糖基，结合分子量和极性，鉴定它为化合物M1 的苷元α-苦丁内酯（α-kudinlactone）。

3.2 苦丁茶冬青皂苷D 代谢途径分析 由代谢产物的鉴定结果可知，苦丁茶冬青皂苷D 在大鼠肠道菌群代谢作用下主要发生脱糖基反应（图3）。冬青皂苷D 与肠道菌群共孵育后，会脱去末端的支链糖（鼠李糖基或葡萄糖基），代谢为二糖苷苦丁茶冬青苷P 和苦丁茶冬青皂苷LZ11，继续水解转化为单糖苷，最终代谢生成苷元。

4 讨论

本实验以苦丁茶冬青皂苷D 与离体大鼠肠道菌群厌氧共孵育，采用UPLC-ESI-Q-TOF-MS／MS 进行代谢产物的分析。根据精确相对分子质量数据和特征离子碎片，鉴定其中4 种主要代谢产物，推测代谢途径主要是脱去糖基反应。

肠道菌群是影响中药皂苷类成分口服吸收的重要因素，例如人参皂苷（Ginsenosides）［9-10］，同时发现肠道菌群的组成也会影响皂苷类成分的代谢过程和代谢产物，例如罗汉果中的皂苷类成分［11］，因此分别研究正常与疾病动物模型体内皂苷的代谢转化对于了解皂苷的吸收具有重要的指导意义。本实验中发现苦丁茶冬青皂苷D 可被离体大鼠肠道菌群代谢转化，其在动物体内受肠道菌群影响的代谢转化还需进一步研究，以便深入了解其药理作用机制。

图2 化合物M1 （A）、M2 （B）、M3 （C）、M4（D）、M5 （E） ESI-MS 色谱图

图3 苦丁茶冬青皂苷D 与SD 大鼠肠道菌群共孵育发生的代谢途径