苓桂术甘汤对慢性心力衰竭大鼠AngⅡ、ET-1、BNP的影响

李雪萍，张宝成，黄 聪，魏蜀君，姚 欢，高永翔

慢性心力衰竭 (chronic heart failure，CHF)是指心脏泵血功能降低，心脏血液输出量减少，不能满足全身组织代谢需要的一种病理生理状态及临床综合征，目前全球心力衰竭病人的数量已高达2 250万人，并且仍以每年200万人的速度递增，且5年存活率与恶性肿瘤相仿[1]。目前研究表明，心室重构是CHF发生发展的重要病理生理机制[2]。心室重构是指为了适应心脏血流动力学而改变心脏结构和功能，以维持正常的心排血量，最终导致失代偿性心力衰竭。心室重构开始时会引起神经内分泌系统大量细胞因子的异常分泌，经过一定的代偿作用后，会使心肌损伤加重，从而导致心功能恶化[3]。 2014年中国心力衰竭指南指出应重视和加强深入探索采用中医药防治心力衰竭，正是当前国内外研究热点之一[4]。中医药治疗CHF积累了丰富的经验，其中以脾胃论治疗效突出，芩桂术甘汤是健脾利水、温阳益饮的经方，张仲景《金匮要略》曰：“心下有痰饮，胸胁支满，目眩，苓桂术甘汤主之”。本课题旨在通过动物实验研究探讨苓桂术甘汤治疗CHF的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 雄性SD大鼠40只， 体质量(220±20)g，批号51203500001623，由四川达硕科技有限公司提供，许可证号：SCXK(川)2015-030。实验环境：清洁级动物房，室内温度维持在20～25 ℃，室内湿度维持在40%～70%，大鼠分笼，并予以普通级饲料及纯净水饲养，每日定时更换饮用水，普通饲料由成都达硕生物科技有限公司提供。

1.1.2 实验药物 苓桂术甘汤临床常用剂量：茯苓20 g，桂枝15 g，白术15 g，炙甘草15 g。购于成都中医药大学附属医院，为新绿色药业中药配方颗粒，性状：浸膏颗粒。阿霉素每瓶10 mg，山西普德药业股份有限公司生产，批号：02160901。地高辛片每盒0.25 mg，30片，上海信谊药厂有限公司生产，批号：02160607。

1.1.3 仪器与试剂 低温离心机(德国HERASE)；酶标仪(Varioskan Flash美国热电公司)；Vivid E9彩色多普勒超声诊断仪(美国GE公司)；SD大鼠血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ) ELISA试剂盒，由南京建成生物工程研究所提供，生产批号：Lot#R20170824；SD大鼠内皮素-1(ET-1)ELISA试剂盒，由南京建成生物工程研究所提供，生产批号：Lot#R20170824；SD大鼠脑钠肽(BNP)ELISA试剂盒，由南京建成生物工程研究所提供，生产批号：Lot#R20170824。

1.2 心力衰竭模型建立及分组方法 选用清洁级雄性SD大鼠，适应性喂养1周后，再运用统计学软件SPSS 20.0进行随机数字分组，使用3%苦味酸溶液编号。随机分为空白组(7只)与造模组(33只)。其中造模组在造模成功后再随机分为模型组、地高辛组、苓桂术甘汤组，每组11只。

造模方法：大鼠心力衰竭模型的建立，采用阿霉素诱导法[4]。首先用5 mL灭菌注射用水充分溶解阿霉素，混合均匀，再用生理盐水进行稀释，配制成浓度为0.8 mg/mL的试验液，采用1.5 mg/kg剂量对大鼠进行腹腔注射，注射频率为每周2次，连续注射周期为4周；空白组则注射同等剂量的生理盐水，每周2次，共4周。从SD大鼠阿霉素腹腔注射日起开始定期观察SD大鼠的行动活泼度、刺激反应度、体毛颜色、食欲、水肿以及尿量等一般生理情况，并以此为依据初步判断CHF造模是否成功。造模结束后2周内，于各组随机取2只大鼠，行心脏超声心动图检查及病理学切片检查，进一步明确SD大鼠的CHF造模是否成功。

给药剂量：根据人与大鼠体表面积换算公式，苓桂术甘汤组灌胃剂量为6.83 g/(kg·d)，地高辛组灌胃剂量为0.027 mg/(kg·d)，空白组和模型组大鼠灌服同等体积的普通饮用水，按1 mL/100 g 剂量进行灌胃，灌胃持续周期为4周。每4 d称取体重1次，并根据体重变化对用药剂量进行相应调整。为排除昼夜节律的影响，每天灌胃给药时间固定。药物剂量换算参考徐叔云《药理实验方法学》[5]，采用体表面积换算法。

1.3 观察及检测指标

1.3.1 一般情况观察 定期观察和记录整个实验过程，关注各组大鼠饮食和体重变化、行为活动灵敏性和精神状态、身体有无水肿发生、全身皮肤及毛发的变化情况、二便等一般状况。

1.3.2 心脏彩超检测 腹腔注射10%水合氯醛，麻醉大鼠；将大鼠仰卧位固定于操作台上，备皮，充分暴露胸部；检测心力衰竭相关指标，包括左室射血分数(LVEF)、左室短轴缩短率(FS)、左室舒张末期内径(LVEDD)、左室收缩末期内径(LVESD)、左室收缩末期容积(ESV)、左室舒张末期容积(EDV)，所有数据均测量3次并记录。

1.3.3 血清AngⅡ、ET-1、BNP的测定 大鼠连续灌胃4周后，禁食、不禁水12 h，10 %水合氯醛以0.3 mL/100 g剂量对实验大鼠进行腹腔注射。彻底麻醉后开胸暴露心脏，使用一次性真空采血针经心尖部采集血液；收集的血液先于37 ℃恒温锅中静置30 min，再用高速离心机(2 000 r/min)4 ℃离心15 min，将管内上清液吸出，重新分装编号，于-80 ℃冰箱保存。采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清AngⅡ、ET-1、BNP水平，严格按照试剂盒说明书步骤操作。

1.3.4 心脏组织病理学检测 右心室采血结束后，迅速取出大鼠心脏，用生理盐水灌洗，存放于4%多聚甲醛24 h，常规乙醇脱水，石蜡包埋制作成蜡块，连续切片，苏木精-伊红(HE)染色，镜下观察大鼠心肌细胞的形态学改变。

2 结 果

2.1 一般情况观察结果 实验过程中，空白组大鼠精神状态良好、活跃，反应较为敏捷，食量、饮水量正常，无脱毛，二便量、色质均无明显异常。 模型组大鼠出现精神不振，活动量相对减少，饮食量下降，全身毛发脱落且泛黄，无光泽，部分出现腹部隆起，大便稀软。苓桂术甘汤组及地高辛组给药10 d左右后精神状态、活动度、饮食状况改善，15 d后腹部膨隆现象减轻，大便正常。给药结束后，苓桂术甘汤组存活8只，地高辛组存活7只，模型组及空白组各存活5只。

2.2 心脏组织病理形态学改变 正常组心肌细胞排列整齐，细胞核呈卵圆形，着色较浅无深染，未见心肌细胞肥大，间质无炎症细胞浸润；模型组细胞排列疏松，横纹不清楚，心肌纤维及间质发生坏死，细胞水肿，胞质着色变浅，细胞核出现深染改变，有炎症细胞浸润；苓桂术甘汤组和地高辛组心肌细胞肥大、炎症细胞浸润、心肌纤维走形等均得到不同程度的改善。详见图1。

图1 各组大鼠心脏组织HE染色(×100)

2.3 大鼠心脏超声结果 模型组大鼠LVESD值高于空白组，差异有统计学意义(P<0.05)；而模型组大鼠LVEF和LVEDD值低于空白组，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比，苓桂术甘汤组和地高辛组LVESD均有所降低，差异有统计学意义(P<0.05)，提示两个药物组大鼠的左室收缩期心室内径下降，左室收缩功能有所改善；苓桂术甘汤组和地高辛组LVEF和LVEDD均高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)，提示药物组左室舒张期心室内径升高，心排血量增加，心功能改善。与空白组相比，苓桂术甘汤组和地高辛组LVEDD、LVEF明显降低，LVESD明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，提示药物能够改善受损的心功能，但相比正常心脏功能仍有差距。苓桂术甘汤组与地高辛组相比，LVEF差异无统计学意义(P>0.05)；苓桂术甘汤组LVEDD、LVESD较地高辛组降低，差异有统计学意义(P<0.05)，提示苓桂术甘汤对心功能改善的作用效果不及地高辛。模型组心功能明显下降，心室收缩、舒张功能均受损；苓桂术甘汤组和地高辛组均可改善心功能。

模型组大鼠EDV、FS值低于空白组，而ESV高于空白组，差异具有统计学意义(P<0.05)，提示模型组大鼠的心功能相对下降，左心室收缩末期容量增加。苓桂术甘汤组和地高辛组EDV和FS高于模型组，而ESV低于模型组，差异均有统计学意义(P<0.05)，提示苓桂术甘汤、地高辛组心功能改善，左心室收缩末期容量相对降低。苓桂术甘汤组ESV、EDV、FS与地高辛组比较差异无统计学意义(P>0.05)。模型组左室心室腔减小，心功能下降；苓桂术甘汤组和地高辛组心室腔容量增大，心室重构延缓，改善心功能。详见图2、表1。

图2 各组心脏超声结果

表1 各组大鼠给药后心功能指标比较(±s)

2.4 各组大鼠BNP、AngⅡ、ET-1水平比较 模型组与空白组比较，BNP、AngⅡ、ET-1水平明显升高(P<0.01)，提示模型组大鼠心脏功能受损，心力衰竭模型造模成功。与模型组比较，苓桂术甘汤组、地高辛组BNP、AngⅡ、ET-1水平均降低(P<0.05或P<0.01)，提示苓桂术甘汤与地高辛在一定程度上能够改善心力衰竭大鼠的心功能。苓桂术甘汤组与地高辛组相比，BNP、AngⅡ、ET-1水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠BNP、AngⅡ、ET-1比较(±s) 单位:ng/L

3 讨 论

导致CHF发生发展的基本机制是心室重构， 它是决定充血性心力衰竭发病率、 病程进展和死亡率的主要因素[6]。心室重构是心脏为了维持正常的心排血量，心肌结构和功能发生变化来适应心脏血流动力学的改变，最终引发失代偿性心力衰竭。心室重构会引起神经内分泌系统中大量细胞因子的分泌异常，经过一定时期的代偿作用，导致心肌损伤加重，进而引起心功能恶化。另有研究表明神经内分泌系统的异常活动，将会引起机体肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)的异常运行。在心力衰竭时， RAAS等自分泌和旁分泌过度激活，表现为血浆 AngⅡ显著升高，其短期效应主要是血管收缩和正性肌力作用，但长期激活则表现为促生长作用，导致心脏结构改变，是心室重构的关键因素[7]。AngⅡ又是 RAAS中起关键作用的效应肽，可以提高心室的前后负荷，促进成纤维细胞的增殖和胶原合成，并能引起心肌间质纤维化和细胞凋亡。在RAAS异常活动中，醛固酮的大量分泌也会加重心肌细胞的损伤和心功能恶化，引起心室重构[8]。所以，如果抑制AngⅡ的过度分泌，就能在一定程度上减慢或逆转心室重构过程，预防或延缓心力衰竭发病过程。除了AngⅡ，内皮素(ET)也是心室重构过程中的重要影响因素，ET是循环系统中内皮细胞产生分泌的一种血管收缩肽，其主要活性成分是ET-1。在许多动物实验和临床研究中，都发现在CHF的发病过程中，对照组血浆中ET-1含量均低于实验组，并证实ET含量的变化对心排血量、体循环和肺循环阻力以及心肌重构、肥厚和纤维化有关[9]。ET-1含量的升高与CHF的预后情况有密切关系[10]。研究表明，CHF早期ET的缩血管作用可能是有益的，但随着时间的推移，ET水平的升高，作用于心肌细胞和传导系统造成心肌细胞内碱化和原癌基因表达，活化磷酸肌醇系统，使心脏功能进一步恶化，它参与 CHF血流动力学紊乱和心肌损伤、心肌细胞肥大的病理过程，一定程度参与了心室重构[11]。

BNP是由心肌细胞合成主要在心室内表达的具有生物学活性的天然激素，它是体内唯一的肾素-血管紧张素-醛固酮受体拮抗剂，BNP水平可反映心室的负荷程度，心室负荷轻度升高即可导致 BNP合成增加，可作为心室功能障碍的敏感指标。在CHF的进程中，BNP可抑制血管紧张素转化酶活性和肾素、醛固酮的释放，通过提高肾小球滤过率来降低集合管对钠的重吸收作用，促进钠的排泄，抑制水钠潴留；而BNP还具有抑制肾上腺素的作用，进一步减小肺动脉和血管的外周阻力，这样不仅可以增加心脏的每搏输出量，还能有效降低心脏的前后负荷，减少心肌细胞的能量消耗；此外，BNP可以抑制系膜细胞和纤维母细胞的增生过程，间接性地延缓心脏左室重构[12]。

综上所述，在CHF的早期阶段，选择性地针对神经内分泌系统异常活动进行调节，可以在一定程度上抑制相关系统激素和神经因子的分泌水平，减慢心室重塑过程，延缓CHF发展。本实验研究结果表明，苓桂术甘汤可以有效降低CHF模型大鼠血浆内BNP、Ang Ⅱ和ET-1的含量。超声心动图检测结果显示，苓桂术甘汤对于延缓CHF模型大鼠的心室重塑过程，改善心功能具有明显的促进作用。根据心肌组织的处理结果得出，苓桂术甘汤可以改善受损的心肌细胞结构，从而改善心功能。这对于目前的临床治疗方法可以提供一定的补充和参考意义。但由于中医方药是复方治疗，其中的药物成分种类多样，经过多种途径作用于多个靶点，从整体上调节机体的功能改善，其内部作用机制相对复杂。因此，苓桂术甘汤的具体作用机制仍有待进一步研究。