黄喉拟水龟Dmrt1基因克隆及其表达特征

欧阳淑 刘晓莉 王亚坤 李 伟 朱新平, 2

(1.中国水产科学研究院珠江水产研究所,农业农村部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室,广州 510380;

2.上海海洋大学,上海 201306)

性别是生命科学的重大命题之一,性别决定及其调控机制一直是遗传学、发育生物学和进化生物学的前沿和热点科学问题之一[1—4]。脊椎动物主要有遗传型性别决定(Genetic sex determination: GSD)和环境型性别决定(Environmental sex determination: ESD)[5—7]两种性别决定方式。目前在动物中关于性别决定机制的研究已取得一定进展,脊椎动物中最早鉴定出的性别决定基因是人类的Sry基因(sex-determining region Y)[8],随后其他一些性别决定基因或性别决定候选基因也相继被研究者发现,如青鳉(Oryzias latipes)中的Dmy基因[9]、非洲爪蟾(Xenopus laevis)中的DM-W基因[10]、鸡和半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)中的Dmrt1基因[11,12]、青鳉(Oryzias luzonensis)的Gsdfy基因[13]、河豚(Takifugu rubripes)中的Amhr2基因[14]、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)的sdY基因等[15]。除了遗传型性别决定基因,一些环境型性别决定和性别分化相关基因的研究也取得了一定的进展,如在龟(Chelydra serpentina)中发现的温度依赖型性别决定候选基因CIRBP[16],及在其他温度依赖型性别决定爬行动物热敏期鉴定的一系列性别决定和性别分化相关基因Dmrt1、Sf1、Rspo1、foxl2等[17]。然而,相对于遗传型性别决定基因的广泛研究,许多环境型性别决定物种的性别调控机制目前还并不是十分清楚。

龟鳖类动物在动物系统进化过程中处于承前启后的地位,其性别决定类型和机制极其丰富[18],因而龟鳖类性别决定的遗传基础及其调控机制的研究一直广受关注。许多龟鳖类在生长和个体大小等重要经济性状上具有显著的性别异性,黄喉拟水龟和中华鳖等雄性个体的生长速度比雌性个体快[19,20],而三线闭壳龟和乌龟在雌性个体中的生长速度比雄性个体快[21]。因此,在深入了解龟鳖类性别决定机制的基础上,对龟鳖类性别发育的操控在龟鳖类育种领域也具有重大的应用价值。

黄喉拟水龟(Mauremys mutica)别称石龟或石金钱,在国外主要分布在越南和日本[22,23],在我国主要分布在广西、广东、海南、福建等地[24]。黄喉拟水龟产卵的时间一般是每年的4—8月[25],其在生长性状上具有明显的性别异型[20]。此外,黄喉拟水龟在高温条件下孵育产生偏雌性子代,在低温条件下孵育产生偏雄性子代,这种性别决定类型为温度依赖型性别决定[26],属于TSD Ia型。黄喉拟水龟性别决定的机制尚不清楚,本研究利用黄喉拟水龟雌雄性腺转录组筛选和克隆性别调控相关基因Dmrt1 cDNA全长序列,通过实时定量PCR分析Dmrt1转录本在成体黄喉拟水龟性腺及胚胎发育时期表达的特征,利用化学原位杂交检测了黄喉拟水龟Dmrt1基因在雄性性腺中的表达。本研究结果为了进一步解析黄喉拟水龟性别决定机制提供一定的基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本研究从中国水产科学研究院珠江水产研究所野生动物繁育基地选取成年黄喉拟水龟及受精卵,从中分别选取3冬龄雌、雄黄喉拟水龟各9只。用无酶剪刀剪取心、肾、眼、肝、脾、脑、肌肉、卵巢、精巢等各组织,保证全程无菌操作并迅速将样品放置于TriPure isolution Reagent(Trizol,赛默飞世尔科技公司,广州)中,保存于-80℃冰箱备用;另取一部分性腺组织浸于4%多聚甲醛(Paraformaldehyde,PFA)中进行固定,然后用甲醇对样品进行梯度脱水处理并放置-20℃冰箱中保存备用于切片。

收集来自黄喉拟水龟所产的受精斑明显的龟卵,将受精卵埋入湿度适宜且混合均匀的蛭石中。孵育过程在恒温孵化箱进行孵化,孵化全程空气湿度恒定,为80%。孵化条件分别设置为25(±0.5)℃和32(±0.5)℃,其中每个孵化温度共孵育120枚受精卵。当胚胎发育至14期时,将32℃孵化下的50枚受精卵转至25℃孵化,再将25℃孵化下的50枚受精卵转至32℃孵化。分别取25℃、32℃、25℃转到32℃、32℃转到25℃等不同孵化温度下性腺不同发育阶段(14期、16期、19期、22期、25期)的样品,每个发育时间点取10枚受精卵,将取的性腺样品置于-80℃冰箱中超低温保存,所取组织将用于RNA提取,各个发育时期的确定参照先前的报道[27]。

1.2 黄喉拟水龟Dmrt1基因cDNA克隆

总RNA提取与cDNA合成用Trizol法提取黄喉拟水龟成体各个组织样品、不同发育阶段的受精卵性腺的总RNA并用DNA酶Ⅰ(威佳科技有限公司,广州)去除基因组DNA污染。本实验为了检测RNA 的完整性、浓度及纯度,分别进行了琼脂糖凝胶电泳和NanoQTM紫外分光光度计检测。

Dmrt1基因cDNA克隆根据本实验室已有的黄喉拟水龟雌雄性腺转录组数据,通过基因注释筛选出转录组中的黄喉拟水龟Dmrt1基因序列,设计特异性上下游引物Dmrt1-F1和Dmrt1- R1以性腺组织(精巢和卵巢)的cDNA为模板扩增黄喉拟水龟Dmrt1片段(表1)。反应条件如下: 94℃预变性2min;94℃ 30s,55℃ 40s,72℃ 120s,33个循环;72℃延伸10min;4℃。用雄性黄喉拟水龟精巢总RNA,以SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit(Clontech,

美国)合成5′-RACE和3′-RACE cDNA的第一条链,以合成5′-RACE和3′-RACE 的cDNA第一链为模板进行PCR扩增,分别合成Dmrt1 5′UTR及3′UTR,所用引物如表1所示。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,回收目的条带后用pMD19-T载体(TaKaRa)进行连接,再利用DH5α感受态细胞进行转化、克隆和筛选,最终获得的阳性克隆由广州天一辉远生物科技有限公司进行测序。

黄喉拟水龟Dmrt1基因序列分析使用DNAstar将5′-RACE、3′-RACE及Dmrt1片段拼接,使用ORF finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)预测ORF及氨基酸序列。分别对核苷酸序列及氨基酸序列进行比对通过NCBI库中的BLASTN软件和BLASTP软件。最后通过MEGA 6,再利用邻近法(Neighbour-joining,NJ)进行构建系统进化树,采用自举法(Bootstrap,Felsenstein 1985)1000次来检验树中各节点的置信度。

表 1 本研究所用引物序列Tab.1 Primers and their sequences used in this experiment

1.3 组织特异性分析

利用测序所得黄喉拟水龟Dmrt1 cDNA的序列进行特异性上下游引物的设计(表1),本实验以Gapdh基因为内参基因,以此来设计上下游引物Gapdh-F和Gapdh-R(表1)。以成体黄喉拟水龟卵巢、精巢、心、肝、脾、肾、肌肉、眼、脑组织及25℃和32℃性腺不同发育阶段提取总RNA并转录合成的cDNA为模板进行 RT-qPCR,每组样品至少重复检测3次。使用Applied Biosystems Step One Plus Real-Time PCR Systems进行扩增反应,采用2-∆∆Ct法来计算相对表达量。RT-qPCR反应条件如下所示: 95℃ 3min;95℃ 15s,60℃ 30s,72℃ 30s,40个循环;其中95℃ 15s,60℃ 30s,95℃ 15s为溶解曲线的程序。本实验采用SPSS统计分析软件并通过Duncan’s法进行多重分析比较,其中当P＜0.05 时表示差异显著。

1.4 细胞定位分析

RNA探针制备使用ApaⅠ和SacⅡ限制性内切酶分别线性化含黄喉拟水龟Dmrt1 cDNA片段的质粒,回收产物依照SP6/T7 Enzyme Mix(Invetrogen)digoxigenin(DIG)RNA Labeling 试剂盒(Roche)合成正(检测目标信号)、反义探针(阴性对照),并用Licl(Invetrogen)沉淀法纯化探针备用,具体步骤参考相关文献[28]。

冰冻切片化学显色原位杂交(AP)分析将所取组织置于固定液中进行固定过夜,第二日固定后用酒精进行梯度脱水再将组织置于蔗糖溶液中并进行包埋和冰冻切片处理(厚度约4—5 μm),最后置于45℃烘箱中30min,再参照化学显色原位杂交方法操作本实验。本实验原理为通过鼠抗地高辛标记并与探针进行结合,再进行显色反应,最后AP阳性显浅紫色,用PI复染细胞核显红色。

2 结果

2.1 黄喉拟水龟Dmrt1基因的序列克隆及分析

本研究通过PCR克隆获得了长度为1811 bp的黄喉拟水龟Dmrt1 cDNA序列,其中包括5′端的非编码区129 bp,3′端的非编码区572 bp及开放阅读框1110 bp,具有保守polyA序列,共编码370个氨基酸(GenBank登录号: MT363640)。

氨基酸序列同源性比对显示黄喉拟水龟Dmrt1与红耳龟(Trachemys scripta)的同源性最高,达97.57%;与龟鳖类中西部锦龟(Chrysemys picta)和草龟(Mauremys reevesii)同源性次之,分别为97.30%和96.77%;与中华鳖(Pelodiscus sinensis)Dmrt1同源性为75.54%;而小鼠(Mus musculus)和人(Homo sapiens)的同源性依次为63.25%和63.16%;其与鱼类如中华鲟(Acipenser sinensis)的同源性较低,为21.62%。系统进化树结果(图1)显示: 黄喉拟水龟与草龟、红耳龟、西部锦龟、中华鳖亲缘关系最近,聚为一个小的分支,接着是与鳄类及鸟类亲缘关系较近,最后依次与哺乳类、两栖类及鱼类聚为一个分支,与鱼类亲缘关系最远。因此,Dmrt1系统进化树的分支和物种的进化关系基本一致。

2.2 黄喉拟水龟Dmrt1 mRNA的组织表达分析

本研究选用的内参基因为Gapdh基因[29],通过实时荧光定量PCR对成年雌雄黄喉拟水龟心、肝、脾、肾、眼、脑、肌肉、卵巢、精巢进行Dmrt1的组织表达分析。定量结果显示雌雄黄喉拟水龟Dmrt1在心、肝、脾、肾、眼、脑、肌肉等组织中表达均极低,在卵巢中表达量较少,但在精巢中呈现高度表达状态,且表达量显著高于其他组织(图2)。

2.3 黄喉拟水龟胚胎发育各时期Dmrt1 mRNA在性腺中的特异性表达分析

实时荧光定量PCR结果显示,产雄温度(25℃)以及从32℃转移到25℃下黄喉拟水龟Dmrt1基因在性腺分化启动前的第19期(图3C、图3H)雄性特异性开始表达,且在胚胎发育后期的22期(图3D、图3F、图3H)及25期(图3E、图3H)一直维持较高的表达水平,而在产雌温度(32℃)以及从25℃转移到32℃下各个胚胎发育时期的表达水平均较低(图3G、图3H)。

2.4 黄喉拟水龟Dmrt1基因 mRNA在精子发生过程中的表达分布

化学显色原位杂交结果显示,在3龄黄喉拟水龟精巢中,Dmrt1 mRNA信号在主要在支持细胞中表达,在精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞中有少量表达,在精子和精细胞中几乎不表达(图4)。

3 讨论

脊椎动物性别调控机制的研究对于性控育种、物种保护及物种繁育具有显著应用价值。温度依赖型性别决定(TSD)是环境型性别决定的主要类型,在龟类(turtles)、蜥蜴(Pogona vitticeps)、鳄鱼(Alligator mississippiensis)、壁虎(Eublepharis macularius)等爬行动物中广泛存在。目前,相对于遗传型性别调控机制研究的深度,温度依赖型性别决定及性别分化的分子机制尚不是很清楚。

前期研究表明,Dmrt1基因是拥有保守DNA结合区域(DM domain)的雄性决定调控因子,在脊椎动物精巢分化和发育过程中作用很大[30,31]。在具有ZZ/ZW性别决定系统的鸟类如鸡中,Dmrt1在雄性个体的表达量远高于雌性个体,且通过RNA干扰技术将Dmrt1基因沉默后,会导致ZZ基因型的胚胎表现出雌性性状,表明Dmrt1基因与鸡的精巢分化有着密不可分的关系[12]。在雌核生殖的多倍体银鲫(Carassius gibelio)中Dmrt1基因主要在支持细胞中表达,在精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞中也有少量表达,说明早期表达的Dmrt1可能与雄性生殖细胞决策和精子发生起始相关联[32],这与哺乳动物中Dmrt1在未分化和正在分化的精原细胞中的表达模式相类似,决定了精原细胞是进入减数分裂还是有丝分裂[33]。本研究通过RACE-PCR克隆得到了黄喉拟水龟Dmrt1基因的全长cDNA序列,系统进化树分析结果表明其与红耳龟(Trachemys scripta)、西部锦龟(Chrysemys picta)和草龟(Mauremys reevesii)的亲缘关系较近,与鱼类亲缘关系较远(图1),且具有保守性极高的DM结构域。通过反转录实时定量PCR对成年黄喉拟水龟Dmrt1基因的组织差异表达分析,结果显示在黄喉拟水龟雌雄成年个体的不同组织中,Dmrt1基因在精巢中呈现极高的表达量,并且显著高于卵巢及其他体组织(图2)。化学原位杂交结果显示Dmrt1 mRNA信号主要集中在支持细胞中,在初级精母细胞、次级精母细胞中信号较弱,而在精细胞和精子中未检测到信号。Ge等[34]在发现支持细胞的细胞核上,红耳龟(Trachemys scripta)DMRT1蛋白有表达,对Dmrt1基因进行敲低处理后,雄性特异性Sox9的表达量随着雄性胚胎组织特征雌性化而显著降低[34]。以上研究表明,Dmrt1是广泛参与脊椎动物性别决定和性腺的分化过程的重要调控基因。

图1 Dmrt1基于邻接法构建的系统进化树Fig.1 Phylogenetic tree constructed through the neighbor-joining method

图2 Dmrt1基因多组织tissues转录本的组织特异性表达Fig.2 The mRNA expression of Dmrt1 in multiple tissues

图3 Dmrt1基因在胚胎发育各时期性腺组织中的特异性表达Fig.3 The expression of Dmrt1 gene in gonad tissues at different stages of embryonic development

在脊椎动物的系统进化过程中,遗传性别决定和环境性别决定这两种看似差异显著的性别决定方式往往并不是对立的,在银汉鱼(Odontesthes bonariensis)中遗传型性别决定和环境依赖型性别决定同时存在[35],在澳大利亚松狮蜥(Pogona vitticeps)中通过性逆转能够促使遗传型性别决定迅速向温度依赖型性别决定转变[36]。一些遗传型性别调控基因如Amh、Sox9等在环境型性别决定物种如红耳龟中也呈现出雌雄差异性表达,表明这些保守性基因及其介导的信号级联通路有可能在环境型性别决定物种中同样存在。在本研究中,我们发现Dmrt1在黄喉拟水龟产雄温度(25 ℃)下性腺分化的第16期中就已开始表达,此外相较于雌性性腺,Dmrt1在不同发育时期雄性性腺中呈现高特异性表达,当把胚胎由产雌温度转移到产雄温度时,Dmrt1表达量又急剧上升(图3),表明Dmrt1基因可能是参与了黄喉拟水龟早期雄性性腺分化过程。在其他龟鳖类如中华鳖(Pelodiscus sisinensis)中,Dmrt1在其雄性性腺分化之前的16期便开始特异表达,且其表达受雌激素的影响[37]。且在红耳龟(Trachemys scripta)中,相较于Sox9和Amh基因,Dmrt1基因在雄性性腺中的表达要更早,说明Dmrt1处于温度依赖型性别决定信号通路的上游位置,并且介导了下游一些与性别调控相关基因的表达,在异型性性腺向精巢分化过程中扮演了重要角色。

图4 Dmrt1 转录本在精巢中的表达Fig.4 The Dmrt1 mRNA expression in testis

综上所述,Dmrt1可能是黄喉拟水龟早期雄性分化过程中的关键调控基因,然而,由于龟鳖动物中基因编辑技术的缺乏,使得我们对于黄喉拟水龟性别调控相关基因功能的研究有限。本实验室目前已进行了黄喉拟水龟性腺细胞的分离及体外培养,获得了生长良好且能稳定传代培养的精巢和卵巢细胞系(未发表数据),为后续对Dmrt1等性别调控相关基因功能的探索以及温度调控性别的分子机制奠定了基础。