超声协同复合酶法提取番茄红素及体外模拟消化对抗氧化活性的影响

李昌宝 辛明 唐雅园 孙健 李丽 零东宁 何雪梅 盛金凤 刘国明 邓军

摘要：【目的】優化圣女果番茄红素提取工艺，并分析其抗氧化活性，为提高圣女果番茄红素的开发利用提供理论依据。【方法】在单因素试验基础上，通过响应面法优化圣女果番茄红素超声协同复合酶提取最佳工艺条件，并考察经人工胃液和肠液体外模拟消化后番茄红素清除1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH·）能力的变化情况。【结果】各因素对圣女果番茄红素提取量的影响排序为超声时间>酶解温度>复合酶添加量>料液比。3个单因素（复合酶添加量、酶解温度和超声时间）及料液比与复合酶添加量、料液比与超声时间、复合酶添加量与酶解温度、酶解温度与超声时间的交互作用对圣女果番茄红素提取量影响极显著（P<0.01）。圣女果番茄红素最优提取工艺条件为：料液比1∶40、复合酶添加量3.6%、酶解温度54 ℃、超声时间22 min，在此工艺条件下，圣女果番茄红素的提取量为410.94±1.78 μg/g，与模型预测值（412.62 μg/g）接近。圣女果番茄红素对DPPH·、羟基自由基（·OH）和超氧阴离子（O[-2]·）的清除能力具有一定的量效关系，均明显高于同浓度的2，6-二叔丁基对甲酚（BHT）。体外模拟消化后的圣女果番茄红素对DPPH·的清除率减小，且圣女果番茄红素浓度越高，清除率降幅越小。【结论】采用响应面法优化的工艺条件可用于圣女果番茄红素提取，且提取得到的圣女果番茄红素具有较强的抗氧化能力，可为后续圣女果的开发利用提供技术支持。

关键词： 番茄红素;超声波;复合酶;抗氧化活性;模拟肠胃道消化

Abstract：【Objective】The present study was intent to optimize extraction process conditions of lycopene from cherry tomato and analyze its antioxidant activity，as well as provide a scientific foundation for further exploring cherry tomato lycopene. 【Method】Based on single factor experiments， response surface methodology（RSM） was applied to optimize conditions of ultrasonic-assisted complex enzyme extraction of lycopene from cherry tomato. The changes in 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl（DPPH·） radical scavenging activity of lycopene after in vitro simulated digestion in artificial gastric juice and artificial intestinal juice were investigated as well. 【Result】The rank of important influence factors on extraction rate of lycopene was ultrasonic time>enzymolysis temperature>composite enzyme amount>material to liquid ratio. The interaction between three factors（composite enzyme concentration，composite enzyme amount and ultrasonic time） and four interactions（material-to-liquid ratio and enzyme concentration，material-to-liquid ratio and ultrasonic time，composite enzyme amount and enzymatic hydrolysis temperature，and enzymatic hydrolysis temperature and ultrasonic time） had extremely significant influence on the lycopene extraction amount（P<0.01）. The optimal extraction condition was as follows：material to liquid ratio of 1∶40， composite enzyme amount of 3.6%， enzymolysis temperature of 54 ℃ and ultrasonic time of 22 min. Under this condition，the extraction quantity of cherry tomato lycopene was 410.94±1.78 μg/g，which was consistent with the predicted value of model（412.62 μg/g）. The lycopene from cherry tomato showed dose-dependent scavenging activities against DPPH·，hydroxyl radical（·OH） and superoxide anions（O[-2]·） scavenging activity. The radical scavenging capacities of lycopene were greatly stronger than those of 2，6-di-tert-butyl-p-cresol（BHT） under the same concentration. The radical scavenging activity of lycopene to DPPH· was decreased after in vitro gastrointestinal digestion. When the concentration of lycopene was higher，the radical scavenging activity decrease was smaller. 【Conclusion】The ultrasonic-assisted complex enzyme extraction conditions of lycopene from cherry tomato is optimized by RSM. Lycopene from cherry tomatoes has strong antioxidant activity. Therefore，this research can provide a scientific foundation for deve-loping cherry tomato industry in future.

Key words： lycopene; ultrasound wave; composite enzyme; antioxidant activity; simulated gastrointestinal digestion

0 引言

【研究意义】圣女果（Lycopersicon esculentum Mill.）又称樱桃番茄、小番茄等，属茄科番茄属植物，被联合国粮农组织（FAO）列为优先推广的四大水果之一（常培培等，2014;Hu et al.，2017）。与传统番茄相比，圣女果中富含番茄红素（王月华等，2014）。番茄红素是成熟番茄的主要色素，是一种天然的脂溶性色素，具有清除人体内自由基、预防癌症、减少心血管疾病、抑制肿瘤、提高人体免疫力及延缓衰老等多种生理功效，被世界卫生组织（WHO）和FAO认定为A类营养素，广泛应用于保健食品、医药和化妆品（Ansari and Gupta，2003;Yang et al.，2013;Taheri et al.，2015）。近年来，番茄红素提取工艺已成为国内外功能性食品研究领域的一大热点，对开发高质量番茄红素产品以满足人们保健的需求也具有重要意义。【前人研究进展】目前，国内外对番茄红素的提取方法研究较多（张雅琦，2019），而圣女果中番茄红素的提取方法主要有有机溶剂提取法和超声波提取法。李丽杰和武瑞赟（2012）研究氯仿、乙醚、丙酮和正己烷等不同有机溶剂对圣女果番茄红素的提取效果，结果表明丙酮—正己烷（2∶1）为最佳提取溶剂;宋力等（2012）以香油为溶剂从圣女果中提取番茄红素，结果表明，在料液比1∶1、萃取4 h条件下所得的提取液具有较好的抗氧化效果;Cefali等（2015）分析了不同品种番茄的番茄红素含量，其中Salad的番茄红素含量最高（0.0039 μg/mL），且具有较强抗氧化能力;劉钰华等（2017）采用超声辅助有机溶剂法提取圣女果中的番茄红素，在优化的提取工艺条件下，获得番茄红素提取量为63.2 μg/g;Ustundas等（2018）采用超声辅助法提取番茄干粉中的番茄红素，结果表明，超声辅助比常规溶剂提取效果更好，番茄红素提取量为722.321 mg/kgDW，抗氧化能力为12.48 mg Trolox/gDW;Catalkaya和Kahveci（2019）利用纤维素酶和果胶酶复合酶对工业番茄废料进行预处理后，通过有机溶液提取番茄红素，所得的番茄红素浓度为11.5 mg/g。【本研究切入点】虽然已有不少关于圣女果番茄红素提取方面的研究报道，但尚未见利用超声协同复合酶法提取的相关报道，且通过体外模拟消化考察番茄红素抗氧化能力的报道也较少。超声波是利用其振动空化作用、机械效应及机械剪切作用对原料进行破碎，加速目标物质的溶出（陈燊等，2015）。生物酶具有水解纤维素、果胶和糖蛋白的作用，能破坏植物细胞，促进细胞内有效成分快速溶出（Wen et al.，2017）。超声协同复合酶法可同时实现两种技术优势，具有高效、快速和环保等特点，能更好地提高提取效率。【拟解决的关键问题】采用超声协同复合酶法提取圣女果中番茄红素，通过响应面法优化其提取工艺，并采用体外模拟消化考察番茄红素的抗氧化能力，明确番茄红素在模拟体液环境中的真实抗氧化值，为开发圣女果番茄红素功能性食品提供技术参考。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

圣女果由广西壮乡河谷农业科技有限公司提供;1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH·）、2，6-二叔丁基对甲酚（BHT）、胃蛋白酶溶液、吐温-40、胰蛋白酶、无水乙醇、乙酸乙酯、氯化钠、氯化钾、氯化钙、磷酸二氢钾、碳酸氢钠和氢氧化钠等均为分析纯，购自沧州临港滨海化工有限公司;番茄红素标准品购自北京化学试剂公司;果胶酶（50000 U/g）和纤维素酶（50000 U/g）购自上海瑞永生物科技有限公司;试验用水为二次去离子水（实验室自制）。主要仪器设备：GENESYS 10S紫外—可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）、WGLL-230BE鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）、3K15高速冷冻离心机[曦玛离心机（扬州）有限公司]、JTS-1012型高功率数控超声数控清洗器（深圳市洁盟清洗设备有限公司）、破壁机（深圳万德电器有限公司）、PGL精密天平（深圳市怡华新电子有限公司）和电子天平（成都豪创光电仪器有限公司）。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 提取工艺流程 新鲜圣女果→清洗→打浆（破壁）→加入复合酶→酶解→灭酶10 min→加入乙酸乙酯→超声辅助提取→过滤→番茄红素提取液备用（测定时校正提取液透光率）。

1. 2. 2 番茄红素标准曲线制定 参考苏文贵（2013）的方法，配制系列番茄红素标准品溶液，采用比色法测定其吸光值。以吸光值为纵坐标、番茄红素质量浓度（μg/mL）为横坐标进行回归拟合，得到回归方程y=0.0017x+0.0071（R2=0.9996）。

1. 2. 3 样品中番茄红素提取量测定 从标准曲线中查得圣女果番茄红素提取液中番茄红素的质量浓度，根据以下公式计算提取量。

式中，X为番茄红素提取量（μg/g），C为提取液中番茄红素质量浓度（μg/mL），V为提取液体积（mL），n为提取液测定时的稀释倍数，m为样品质量（g）。

1. 2. 4 单因素试验

1. 2. 4. 1 复合酶比例的影响 固定料液比1∶10、复合酶添加量1.0%、酶解时间2.0 h、酶解温度50 ℃、超声时间20 min和超声功率210 W，考察复合酶比例[果胶酶∶纤维素酶=0∶1、1∶0、1∶1、2∶1、3∶1、1∶2、 1∶3（质量分数比）]对圣女果番茄红素提取量的影响。

1. 2. 4. 2 料液比的影响 固定复合酶比例1∶2、复合酶添加量1.0%、酶解时间2.0 h、酶解温度50 ℃、超声时间20 min和超声功率210 W，考察料液比（1∶5、1∶10、1∶20、1∶30和1∶40）对圣女果番茄红素提取量的影响。

2. 1. 4 酶解时间对番茄红素提取量的影响 由图4可知，酶解时间在0.3～3.0 h时，圣女果番茄红素提取量显著上升，在3.0 h时番茄红素提取量达最大值（192.27 μg/g）;3.0 h后提取量反而显著降至139.75 μg/g，可能是随着加热时间的延长使得圣女果番茄红素的活性结构发生变化，稳定性下降而致使提取量下降（李广志等，2018）。故选择最佳酶解时间为3.0 h。

2. 1. 5 酶解温度对番茄红素提取量的影响 由图5可知，当酶解温度低于50 ℃时，圣女果番茄红素提取量随酶解温度的升高而上升，从130.81 μg/g增至166.25 μg/g，且在50 ℃时达最大值;当酶解温度超过50 ℃时，番茄红素提取量显著下降，从166.25 μg/g降至150.72 μg/g。这可能是温度升高有助于酶解效率的提高和圣女果番茄红素的扩散，但酶解温度超过50 ℃时，长时间加热使得大部分纤维素酶和果胶酶被破坏，发生不可逆变性，影响细胞破壁（王莹等，2018）。因此，选择最佳酶解温度为50 ℃。

2. 1. 6 超声时间对番茄红素提取量的影响 由图6可知，随着超声时间的延长，圣女果番茄红素提取量先升高，当超声时间为15 min时提取量达最大值，之后继续延长超声时间，提取量缓慢下降，可能是超声波的长时间机械振动会导致溶出的番茄红素发生结构破坏而部分降解。故选择最佳超声时间为15 min。

2. 1. 7 超声功率对番茄红素提取量的影响 由图7可知，随超声功率的增加，圣女果番茄红素提取量先升后降，其原因可能是超声功率过低不利于番茄红素溶出，而超声功率过高会破坏番茄红素，导致其提取量降低。在超声功率为210 W时，番茄红素提取量最大，因此选择最佳超声功率为210 W。

2. 2 响应面优化提取工艺

2. 2. 1 响应面试验结果 依据单因素试验结果选定的因素水平，以料液比（A）、复合酶添加量（B）、酶解温度（C）和超声时间（D）为自变量，圣女果番茄红素提取量（Y）为因变量进行响应面试验，Box-Benhken试验设计及结果见表2，方差分析结果见表3。采用Design Expert 8.0.6对表2数据进行二次回归方程拟合，得到番茄红素提取量（Y）对自变量料液比（A）、复合酶添加量（B）、酶解温度（C）和超声时间（D）的二次多项回归方程：Y=-1221.90-6.03A-126.75B+64.48C+16.08D+0.70AB+0.03AC+0.15AD+3.99BC-0.91BD+0.45CD-0.01A2-11.71B2-0.83C2-0.91D2。

从表3可知，所获得的回归模型极显著（P<0.01，下同），失拟项不显著（P>0.05，下同），说明模型有效，能较好地预测试验值。一次项B、C和D对圣女果番茄红素提取量影响极显著，A对其影响不显著;交互项AB、AD、BC和CD对番茄红素提取量影响极显著，AC和BD对其影响不显著;二次项B2、C2和D2影响极显著。由F值得出对圣女果番茄红素提取量的影响排序为：超声时间>酶解温度>复合酶添加量>料液比。

2. 2. 2 响应面交互作用分析结果 图8为4个因素对圣女果番茄红素提取量影响的响应曲面图，可看出各因素的最佳水平及因素间的交互作用，曲面图的陡峭程度显示出各因素对番茄红素提取量的影响程度，响应曲面坡度越陡，说明该因素影响较大。从图8可看出，料液比与复合酶添加量、料液比与超声时间、复合酶添加量与酶解温度及酶解温度与超声时间交互作用的响应曲面坡度较陡，交互作用显著;料液比与酶解温度及复合酶添加量与超声时间交互作用的响应曲面坡度较平缓，说明其交互作用对圣女果番茄红素提取量的影响不显著。这与表3的方差分析结果一致。

2. 2. 3 最优提取条件的确定及验证结果 由Design Expert 8.0.6得到圣女果番茄红素最佳提取条件：料液比1∶39.95、复合酶添加量3.65%、酶解温度53.93 ℃、超声时间21.96 min，在该工艺条件下，圣女果番茄红素提取量的预测值为412.62 μg/g。为检验结果的可靠性，进行验证试验。根据实际可操作性，将上述工艺参数修正为：料液比1∶40、复合酶添加量3.6%、酶解温度54 ℃、超声时间22 min，根据此条件进行验证试验，得到圣女果番茄红素提取量为410.94±1.78 μg/g，与预测值接近，因此确定此条件为圣女果番茄红素的提取工艺参数。

2. 3 圣女果番茄红素抗氧化活性分析结果

2. 3. 1 圣女果番茄红素对DPPH·的清除作用 由图9可知，在试验浓度范围内，圣女果番茄红素和BHT对DPPH·的清除率具有一定的量效关系，均随浓度的增加而增大，且圣女果番茄红素对DPPH·的清除率明显高于BHT，当浓度达100 μg/g时，圣女果番茄红素和BHT对DPPH·的清除率分别为70.56%和49.35%。圣女果番茄红素和BHT清除DPPH·的IC50分别为45.97和127.02 μg/g，说明圣女果番茄红素具有较强的DPPH·清除能力，且强于抗氧化剂BHT。

2. 3. 2 圣女果番茄红素抑制·OH的能力 由图10可知，在试验浓度范围内，圣女果番茄红素对·OH的抑制能力随浓度的增加呈快速上升趋势，抑制能力从41.45 U/mL上升至76.24 U/mL;BHT对·OH的抑制能力随浓度的增加而缓慢增强，抑制能力从12.01 U/mL上升至19.18 U/mL。圣女果番茄红素和BHT抑制·OH的IC50分别为24.41和165.22 μg/g，表明圣女果番茄红素对·OH的抑制能力明显强于抗氧化剂BHT，即圣女果番茄红素具有较强的抗氧化性。

2. 3. 3 圣女果番茄红素抑制O[-2]·的能力 由图11可知，在试验浓度范围内，圣女果番茄红素和BHT对O[-2]·的抑制能力随浓度的增加呈上升趋势，圣女果番茄红素的抑制能力从265.63 U/mL升至501.09 U/mL，BHT則从169.27 U/mL升至231.25 U/mL。圣女果番茄红素和BHT抑制O[-2]·的IC50分别为27.19和177.65 μg/g，说明圣女果番茄红素具有较强的O[-2]·抑制能力，且明显强于抗氧化剂BHT。

2. 4 體外模拟消化对圣女果番茄红素抗氧化活性的影响

2. 4. 1 人工胃液模拟消化对圣女果番茄红素抗氧化特性的影响 由表4可知，经体外胃液模拟消化后，圣女果番茄红素清除DPPH·的能力均有所降低。20 μg/mL圣女果番茄红素的DPPH·清除率从18.69%降至11.54%，降幅38.26%;40 μg/mL圣女果番茄红素的DPPH·清除率从37.38%降至30.52%，降幅18.35%;60 μg/mL圣女果番茄红素的DPPH·清除率从52.34%降至45.79%，降幅12.51%;80 μg/mL圣女果番茄红素的DPPH·清除率从68.63%降至62.93%，降幅8.31%。

2. 4. 2 人工肠液模拟消化对圣女果番茄红素抗氧化特性的影响 由表5可知，经体外肠液模拟消化后，圣女果番茄红素清除DPPH·的能力均有所降低。20 μg/mL圣女果番茄红素的DPPH·清除率从18.38%降至11.84%，降幅35.58%;40 μg/mL圣女果番茄红素的DPPH·清除率从37.04%降至32.37%，降幅12.61%;60 μg/mL圣女果番茄红素的DPPH·清除率从51.09%降至45.06%，降幅11.80%;80 μg/mL圣女果番茄红素的DPPH·清除率从70.27%降至63.52%，降幅9.61%。

3 讨论

响应面分析法是采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值间的函数关系，并通过回归方程的分析以寻求最优工艺参数（尹洁，2010;侯银臣等，2019）。近年来，许多活性成分如番茄红素（王振强等，2015）、类胡萝卜素（郑坚强等，2019）等均有利用响应面分析法进行提取工艺优化，在试验过程中通过超声波、复合酶等辅助提取植物活性物质成分，有效提高了生产效率和提取率。刘璐等（2018）利用响应面分析法研究料液比、超声时间和超声功率等因素对番茄皮渣番茄红素提取率的影响，在最佳条件[料液比1∶6（g/mL），超声时间30 min，超声功率200 W]下番茄红素提取率平均为152.52 μg/g。生物酶提取具有提取条件温和、提取时间短及成本低等优点，近年在天然产物的提取中应用广泛。李广志等（2018）选用果胶酶、纤维素酶和半纤维素酶为复合酶，研究了酶配比、酶添加量、酶解时间和酶解温度对番茄红素浓度的影响，结果表明，酶解时间375 min、酶解温度46 ℃的酶解效果最好，滤液番茄红素浓度为13.71 μg/mL。但是单一采用超声提取或生物酶提取的效果均存在一定局限性，超声协同复合酶法可实现这两种技术的优势互补，具有高效、快速和环保等特点，可获得更好的提取效果。超声协同复合酶法至今尚未见在圣女果番茄红素提取上应用，本研究综合超声法和复合酶法提取的优点，以料液比、复合酶添加量、酶解温度和超声时间为考察指标，得到圣女果番茄红素最佳提取条件为：料液比1∶40、复合酶添加量3.6%、酶解温度54 ℃、超声时间22 min，在该条件下圣女果番茄红素的提取量为410.94±1.78 μg/g。这是因为超声波的强烈机械振动和空化效应等作用能使提取溶剂中所有分子的振动频率大幅增加，植物细胞被破碎，提取目标成分快速融入溶剂，从而使提取率提高（马亚琴等，2010;Sahin et al.，2013）;而生物酶可水解纤维素、果胶和蛋白质等，改变细胞壁的通透性（Liu et al.，2012），以提高目标成分的提取率。

近年来，利用体外消化模型研究生物活性物质越来越受到国内外关注。体外模拟消化模型是对人体体内消化系统进行仿生模拟，在食品营养吸收、食品摄入安全评价及药物代谢等方面越来越受重视（闵芳芳等，2013;刘晓庚等，2016）。我国针对番茄红素抗氧化性的研究主要停留在化学抗氧化活性检测方面（李桂江等，2014），但并不能准确反映番茄红素在机体内的真实抗氧化能力。本研究采用体外消化法对圣女果番茄红素抗氧化活性进行研究，结果表明，经人工胃液和肠液模拟消化的圣女果番茄红素，其清除DPPH·的能力均有所降低，且初始浓度越高，圣女果番茄红素对DPPH·清除率的降幅越小，与刘晓庚等（2016）的研究结果基本一致。番茄红素化学结构独特，由11个共轭双键和2个非共轭双键共同构成，比其他胡萝卜素的双键数量多（李娜娜，2015），因此具有较强的清除自由基能力，也是目前发现最强的天然抗氧化剂。

4 结论

采用响应面法优化的工艺条件（料液比1∶40、复合酶添加量3.6%、酶解温度54 ℃、超声时间22 min）可用于圣女果番茄红素提取，且提取得到的圣女果番茄红素具有较强的抗氧化能力，可为番茄红素的提取纯化及开发该类功能性食品提供试验依据。

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（責任编辑 罗 丽）