马齿苋提取物对大肠杆菌的体外抑菌作用探究

金星文

摘 要 为研究不同萃取剂萃取马齿苋有效成分以及不同浓度马齿苋提取物对大肠杆菌的体外抑菌作用，采用水、乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、马齿苋余下水层6种不同的提取溶剂，分别对马齿苋的有效成分进行提取，并浓缩提取液，过滤药液，采用纸片法观察马齿苋提取物对大肠杆菌的抑菌作用。结果表明：不同溶剂的提取液均有抑菌效果，其中马齿苋乙醇提取物的抑菌效果最好，抑菌环可达10.93 mm;水提取物的抑菌效果次之，抑菌环可达9.53 mm。不同浓度乙醇提取液水溶剂提取液中，以50%的乙醇提取液的抑菌效果最好，抑菌环可达12.33 mm。马齿苋乙醇提取物与抗菌药的联合作用中，以马齿苋乙醇提取物与头孢噻呋、痢菌净的联合抑菌效果最好。

关键词 马齿苋;提取物;大肠杆菌;体外抑菌作用

中图分类号：S853.7 文献标志码：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.15.076

马齿苋被人们誉为“天然抗生素”，因为其具有广泛的抗菌作用，对多种细菌和真菌具有一定的抑制性。同时，马齿苋还是食药两用的植物，在我国南北各地都有生长，而且历史悠久。据现代药理研究表明，马齿苋具有抗菌杀虫、抗氧化、抗衰老、耐缺氧、止痢、降血糖、降血脂等药理作用，其提取物对大肠杆菌、志贺氏菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等细菌都有较好的抑制作用。

化学分析表明，马齿苋的化学成分比较复杂，其中主要成分有黄酮类、有机酸类、生物碱类、萜类和香豆素类等，其中黄酮类成分的抑菌效果最为明显。因此，探究马齿苋对大肠杆菌的体外抑菌作用，为马齿苋的抑菌研究提供数据基础。

1 材料与方法

1.1 马齿苋提取液的制备

将采摘回来的马齿苋洗净，烘箱60 ℃条件下烘干，再用粉碎机粉碎成粗粉。

1.1.1 马齿苋水提取液制备

称取50 g的马齿苋粗粉，加适量蒸馏水浸泡24 h后，加热煮沸1 h，过滤药液，重复煎煮3次，然后将滤液合并在一起，浓缩至50 mL，最后得到浓度为1 g·mL-1的浓缩药液。将其灭菌后，密封，4 ℃冷藏备用。

1.1.2 马齿苋乙醇提取液制备

称取50 g的马齿苋粗粉，加入95%的乙醇溶液2 L，混合均匀后，放置在70 ℃条件下，用超声波震荡1 h，过滤药液，重复操作3次，再将药液减压蒸馏，浓缩成干粉，用10%二甲基亚砜溶液溶解，得到1 g·mL-1的药液。将其灭菌后，密封，4 ℃冷藏备用。

1.1.3 马齿苋石油醚提取液制备

称取200 g的马齿苋粗粉，加入70%的乙醇溶液2 L，放置在70 ℃条件下，回流提取药液，然后过滤药液，重复操作3次，将药液减压蒸馏，浓缩成浸膏状，加200 mL去离子水复溶，然后加入200 mL石油醚，进行萃取。分层后取上层石油醚液，下层也继续加入200 mL石油醚萃取，直至石油醚层颜色变为透明。合并多次收集的萃取液，减压蒸馏，浓缩至膏状，用10%二甲基亚砜溶液溶解，得到1 g·mL-1浓度的药液，将其灭菌后，密封，4 ℃冷藏备用。

1.1.4 马齿苋乙酸乙酯提取液制备

用乙酸乙酯对1.1.3中石油醚萃取完成后的水层进行多次萃取，合并萃取液，经减压蒸馏，得到乙酸乙酯的提取物干粉，用200 mL蒸馏水溶解，得到1 g·mL-1浓度的药液，将其灭菌后，密封，4 ℃冷藏备用。

1.1.5 马齿苋正丁醇提取液制备

用正丁醇对1.1.4中乙酸乙酯萃取完成后的水层进行多次萃取，直至正丁醇层变成无色。合并萃取液，经减压蒸馏，得到正丁醇的提取物干粉，用10%二甲基亚砜溶液溶解，得到1 g·mL-1浓度的药液，将其灭菌后，密封，4 ℃冷藏备用。

1.1.6 马齿苋余下水层提取液制备

余下水层经浓缩干燥，用200 mL蒸馏水溶解，得到1 g·mL-1濃度的药液，将其灭菌后，密封，4 ℃冷藏备用。

1.2 含药滤纸片的制备

将药液使用Millex-Cp（孔径为0.22 μm）的过滤器过滤，用移液枪吸取等量的6种不同溶剂的提取液，慢慢滴在已经灭菌后的滤纸片上，晾干，制成6不同的含药滤纸片。

1.3 大肠杆菌菌液制备

取保存于冰箱中的大肠杆菌菌种，用平板画线法将其接种在固体培养基（牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL，调pH达7.6，121 ℃高压灭菌30 min备用）上，培养24 h，挑选单菌落，接种在斜面培养基（马铃薯200 g，按2∶10的比例与水混合后以80 ℃水温加热煮30 min，加蔗糖15～20 g，琼脂20～30 g，蒸馏水定容1 000 mL，自然pH值，121 ℃高压灭菌30 min备用）中，在37 ℃的温度下培养24 h。取之前配好的液体培养基10 mL，洗脱斜面上的细菌，得到菌液。将菌液按10倍依次稀释成3个浓度，用移液枪分别从每个浓度中吸取0.1 mL，涂布在对应的培养基上，分别涂布三次，静置24 h，然后进行平板菌落计数，三者取平均值，算出菌液浓度。用培养基将菌液稀释成（1×106）CFU·mL-1。

1.4 平板的制备

吸取1.3中的大肠杆菌菌液1 mL移入装有9 mL无菌生理盐水的试管，制成25 ug·mL-1菌悬液10 mL，吸取0.2 mL的菌悬液放入90 mm的培养皿中，在培养皿中倒入15 mL的营养琼脂（45 ℃），使培养基与菌液混合均匀。将制备好的含药滤纸片放置在培养皿中心，在35 ℃下培养24 h。做三次平行实验，同时以不含药液滤纸片的培养皿作为对照组，使用十字交叉法，测量抑菌环直径。

1.5 不同浓度的马齿苋乙醇提取物抑菌试验

将直径为6 mm的圆片放入干净的培养皿内，高压蒸汽灭菌，分别浸入马齿苋水提取液和不同浓度的马齿苋乙醇提取物中，其中马齿苋的乙醇提取液浓度分别为30%、50%、70%和95%，分别进行抑菌实验。

1.6 马齿苋乙醇提取物与抗菌药的联合作用试验

为探究马齿苋乙醇提取物联合抗菌药对大肠杆菌菌株有无抑菌作用，对大肠杆菌菌株进行传代培养，分别添加马齿苋乙醇提取物和11种常见的兽用抗菌药，根据最小抑菌浓度的变化情况，对比联合使用和单独使用的抑菌情况。将亚抑菌浓度的马齿苋乙醇提取物添加到浓度为106 CFU·mL-1的菌悬液中，在96孔板的每个小孔中加入100 ?L稀释菌液，在第一列中每孔加入不同抗菌药，使抗菌药最终浓度为2 MIC，中药浓度为0.5 MIC，之后倍比稀释至第11孔，设置两个小孔为中药对照孔。将反应板放置在37 ℃恒温培养箱中培养16 h，此为中药与抗菌药联合作用第一代。第二代与第一代方法相同，只需取第一代孔板的菌液5 ?L轉移至第二代96孔板中。按以上方法培养3代，察记录各代的联合最小抑菌浓度。

2 结果与分析

2.1 不同种类马齿苋提取物对大肠杆菌的抑菌效果

马齿苋不同提取物的抑菌效果见表1。根据表可知，抑菌效果最好的是乙醇提取物，抑菌环直径平均值达到了10.930 mm，与其他种类提取物有极显著性差异。其次是马齿苋水提物，抑菌环直径平均值达到了9.530 mm，而正丁醇提取物的抑菌环直径平均值为9.467 mm，两种溶剂效果相差不大。乙酸乙酯提取物略差，抑菌环直径平均值为3.160 mm;效果最差的是石油醚提取物，其抑菌环直径平均值只有1.230 mm。

2.2 不同浓度乙醇提取液对大肠杆菌的体外抑菌效果

乙醇提取液的抑菌效果最好，水提取液次之，因此探究这两种液体的混合提取液的抑菌效果，见表2。由表可知，50%乙醇提取液对大肠杆菌的体外抑菌作用优于其他4组，抑菌环直径平均值达到了12.33 mm。30%乙醇提取液和70%乙醇提取液的体外抑菌效果相近，抑菌环直径平均值分别为11.56 mm和11.83 mm。由此推测，乙醇和水的混合溶剂比其他单一溶剂的马齿苋提取物提取液对大肠杆菌的抑菌效果好。

2.3 马齿苋乙醇提取物与抗菌药的联合作用

观察表3的抑菌效果MIC值可以看出，马齿苋乙醇提取物与头孢噻呋、痢菌净的联合抗菌作用比较好。与头孢曲松、头孢噻肟、氟苯尼考的联合抗菌作用有一些效果，与阿米卡星联用没有明显变化，说明互不影响。但与环丙沙星、诺氟沙星、左氧氟沙星、克林沙星、林可霉素联用时，MIC值上升，说明这几种抗菌药与马齿苋乙醇提取物会互相抵消。

3 讨论与结论

不同溶剂的提取液均有抑菌效果，其中马齿苋乙醇提取物的抑菌效果最好，抑菌环可达10.930 mm;水提取物的抑菌效果次之，抑菌环可达9.530 mm。不同浓度乙醇提取液中，以50%乙醇提取液的抑菌效果最好，抑菌环可达12.33 mm。马齿苋乙醇提取物与抗菌药的联合作用中，以马齿苋乙醇提取物与头孢噻呋、痢菌净的联合抑菌效果最好。

（责任编辑：赵中正）