胰腺癌患者血清中LncRNA UCA1的表达及临床意义

何勇勇，储成牛，程 利

(1.宣城职业技术学院内科教研室；2.宣城市人民医院普外科，安徽 宣城 242000)

胰腺癌是消化系统恶性肿瘤，因其起病隐匿，发展迅速，导致诊断延迟和预后较差[1]，且胰腺癌发病率逐年上升，死亡率已位居中国恶性肿瘤第七位[2]。手术切除仍然是胰腺癌的主要治疗方法，但肿瘤切除术的患者5年生存率低至6%[3]。提高胰腺癌预后的关键在于早期诊断和早期治疗，通过在高危患者血液中检测相关分子标志物是一种有效方法。目前CA19-9是诊断胰腺癌最可靠的肿瘤标志物，但其阳性率无法令人满意[4-6]。因此，探索高表达胰腺癌相关肿瘤标志物是临床研究领域的热点。长链非编码RNA(LncRNA)是一类长度超过200bp无蛋白质编码功能的转录物[7]，研究证实LncRNA参与肿瘤的发生和发展，并在无细胞的体液中稳定表达和检测[8-12]，众多实验结果表明循环血液中的LncRNA可作为分子标志物用于恶性肿瘤的诊断。例如，Tan等[13]发现多形胶质母细胞瘤患者循环血液中LncRNA HOTAIR高于健康成年人，ROC曲线分析结果证实血清LncRNA HOTAIR诊断多形胶质母细胞瘤曲线下面积为0.913，其敏感性和特异性为87.5%和86.1%；另一项中国研究发现LncRNA CCAT2在胃癌患者血清中高表达，并可用于早期胃癌诊断[14]。

LncRNA UCA1位于人类染色体19p13.12上，最初在膀胱癌中被发现[15]，随后研究发现LncRNA UCA1在食管癌、胆囊癌和肝癌患者血清中表达高于健康对照组[16-18]。然而LncRNA UCA1在胰腺癌中作用研究较少，本研究通过观察LncRNA UCA1在胰腺癌血液中的表达情况，了解其对胰腺癌的诊断和预后价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象选取宣城市人民医院普外科2012年1月至2018年11月收治的胰腺癌患者60例作为研究对象，其中男44例，女16例；年龄47～71岁，平均(60.820±5.916)岁。术后肿瘤标本经两位高年资病理科医生检查均确诊为胰腺癌；患者手术前未经过其他治疗。另收集同期参加常规体检的60名健康志愿者作为对照组，其中男44例，女16例；年龄47～71岁，平均(60.800±5.911)岁。两组患者性别和年龄等资料无差异性。采集胰腺癌患者前术3d、术后7d及健康志愿者空腹静脉血10mL，血液样本2500r/min离心后取上清交与上海吉玛生物公司，该生物公司收到样本后随即对血清中的LncRNA UCA1进行检测。

1.2 血清LncRNA UCA1的检测按Trizol说明书提取胰腺癌患者术前术后及健康志愿者血清中的总RNA，使用紫外分光光度计对RNA进行检测；RNA浓度和纯度合格后按照PrimeScript TM RT reagent kit说明书将其逆转录合成cDNA，反应体系为20μL，反应条件：42℃30min，95℃2min；随后以合成cDNA为模板按照SYBR Premix ExTM TaqⅡ试剂盒说明书配制反应体系和设置反应条件，反应体系为20μL，反应条件：95℃预变性20s，随后95℃10s、60℃25s，循环40次，采用2-△△Ct方法计算血清中LncRNA UCA1相对表达量。LncRNA UCA1上游引物：5'-TTCCTTATTATCTCTTCTG-3'，下游引物：5'-TCCATCATACGAATAGTA-3'；内参GAPDH上游引物：5'-CTCGCTTTGGCAGCACA-3'，下游引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.3 随访患者出院时开始随访，主要方式为电话及门诊随访；截止时间至2019年6月21日，60例胰腺癌患者均死亡，无失访病例。

1.4 统计学方法采用SPSS 17.0软件，LncRNA UCA1表达差异及与临床病理参数间的关系采用t检验；ROC分析LncRNA UCA1对胰腺癌的诊断价值；利用Kaplan-meier描绘胰腺癌患者的生存曲线，Log-rank比较LncRNA UCA1高低表达组间的生存率；Cox回归模型分析影响胰腺癌患者的危险因素。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LncRNA UCA1在胰腺癌患者血清中的表达术前胰腺癌患者血清中LncRNA UCA1表达量高于健康对照组[(3.604±0.753)vs(2.889±0.438)，t=6.361，P<0.001]，和术后胰腺癌患者[(3.604±0.753)vs(2.947±0.415)，t=5.922，P<0.001]，差异具有统计学意义；而术后胰腺癌患者和健康对照组血清中LncRNA UCA1表达差异无统计学意义(t=0.745，P=0.458)。上述结果表明胰腺癌患者血清中LncRNA UCA1表达量显著高于健康人，胰腺肿瘤切除术后其表达量下降至正常健康人水平，见图1。

图1 各组血清中LncRNA UCA1的表达水平比较

2.2 血清中LncRNA UCA1表达对胰腺癌患者临床诊断的可靠性分析ROC曲线分析显示LncRNA UCA1诊断胰腺癌的曲线下面积为0.813(95%CI:0.742～0.845，P<0.01)。诊断胰腺癌的LncRNA UCA1最优截断值为3.295，其敏感性和特异性为65%和85.8%，见图2。

图2 LncRNA UCA1对胰腺癌诊断价值

2.3 血清中LncRNA UCA1表达与病理特征之间的关系统计分析发现胰腺癌患者血清中LncRNA UCA1表达与性别和年龄无相关性(P>0.05)；CA19-9 ≥40 U/L、细胞分化程度低、肿瘤直径>3cm、有淋巴结转移和TNM分期Ⅲ期的胰腺癌患者LncRNA UCA1表达升高，差异具有统计学意义(P均<0.05)，见表1。

表1 LncRNA UCA1表达与胰腺癌病理参数的相关性(n=60)

2.4 血清中LncRNA UCA1表达与胰腺癌患者预后的关系以LncRNA UCA1在60例胰腺癌患者血清中相对表达量(2-△△Ct)的中位值为界，将患者分成LncRNA UCA1高表达组和低表达组。采用Kaplan-Meier法绘制胰腺癌患者生存曲线，分析结果显示LncRNA UCA1高表达组患者中位生存时间为3.9个月(95%CI：3.149～4.651)，无瘤中位生存时间为2个月(95%CI：1.540～2.460)；低表达组中位生存时间为7.6个月(95%CI：5.990～9.210)，无瘤中位生存时间为3个月(95%CI：2.732～3.268)，见图3和图4。Log-rank分析显示LncRNA UCA1高表达组总体生存率和无瘤生存率均低于低表达组，差异有显著统计学意义(χ2=17.222，P<0.001；χ2=14.202，P<0.001)。Cox多因素分析显示胰腺癌患者术前血清中LncRNA UCA1表达、肿瘤分化程度和TNM分期是影响胰腺癌患者总体生存的独立影响因素(P均<0.05)，见表2。

图3 胰腺癌患者血清中LncRNA UCA1表达与总体生存率的关系

图4 胰腺癌患者血清中LncRNA UCA1表达与无瘤生存率的关系

表2 影响胰腺癌患者预后的Cox单因素和多因素分析

3 讨论

近年来，众多研究结果表明LncRNAs与蛋白质编码基因相似可以作为癌基因参与多种肿瘤发生过程，包括增殖、侵袭、迁移和凋亡[8]。随着高通量测序技术快速发展，发现越来越多的功能性LncRNAs具有预测癌症发生和进展的潜在价值。lncRNA UCA1是一种新型的功能性lncRNA，于2006年在人膀胱癌中首次发现[19]。随后的研究表明lncRNA UCA1在多种恶性肿瘤组织中表达上调，如：胃癌、肝癌和肺癌等，并参与肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移和凋亡，在肿瘤的进展、转移和复发中起重要作用[20]。

本研究结果表明术前胰腺癌患者血清中LncRNA UCA1表达量显著高于健康志愿者(P<0.001)，而术后胰腺癌患者血清中LncRNA UCA1表达量较术前显著下降(P<0.001)；ROC曲线结果证实血清中LncRNA UCA1表达可以作为胰腺癌患者早期诊断指标，其曲线下面积为0.813(95%CI: 0.742～0.845，P<0.01)，敏感性和特异性分别为65%和85.8%；进一步统计分析证实细胞分化程度低、肿瘤直径>3cm、有淋巴结转移和TNM分期Ⅲ期的胰腺癌患者LncRNA UCA1表达升高(P均<0.05)。随后采用Kaplan-Meier生存曲线分析LncRNA UCA1与胰腺癌患者的相关性，其结果显示血清高表达LncRNA UCA1的患者总体生存率和无瘤生存率均显著下降(P均<0.001)；Cox多因素分析表明胰腺癌患者术前血清中LncRNA UCA1表达、肿瘤分化程度和TNM分期是影响胰腺癌患者总体生存的独立影响因素(P均<0.05)，这些研究结果显示血清中LncRNA UCA1表达与胰腺癌的发生发展有关。Zhou等[21]的一项研究结果显示LncRNA UCA1可以结合miR-96来调节FOXO3的表达，从而促进胰腺癌细胞的增殖、转移和减少细胞凋亡，这表明UCA1/miR-96/FOXO3轴参与了胰腺癌的进展；Chen等[22]发现LncRNA UCA1能够抑制P27的表达以调节细胞周期和胰腺癌细胞的增殖，高表达LncRNA UCA1患者总生存期较短；此外，Tang[23]等利用基因芯片发现胰腺癌组织中LncRNA UCA1表达高于健康对照组，细胞实验证实LncRNA UCA1可以结合miR-485-p调节FZD7蛋白表达进而通过Wnt通路影响胰腺癌细胞的增殖和侵袭，临床统计分析表明胰腺癌组织中LncRNA UCA1表达可以作为胰腺癌的诊断指标，高表达患者预后较差。这些研究均证实了LncRNA UCA1通过多种途径参与了胰腺癌的发生和发展，可以作为胰腺癌的诊断和预测因子。

本文创新之处在于利用RT-PCR检测出胰腺癌患者血液中LncRNA UCA1的表达高于健康对照组，统计分析证实了血液中LncRNA UCA1表达可以作为胰腺癌患者术前诊断和术后预后判断指标。患者血液样本较肿瘤组织易于采集，因此检测血液中LncRNA UCA1表达具有较高临床实用性，可作为胰腺癌筛查、诊断和预后标志物。但由于本研究样本量较少，仍需扩大样本量进一步验证LncRNA UCA1在胰腺癌中的诊疗价值；同时，继续探索LncRNA UCA1在胰腺癌中具体的致癌机制和生物学行为，为临床诊治提供理论依据。