外泌体长链非编码RNA：肿瘤分子诊断新型标志物*

常文婧 综述，李 冬，孙祖俊 审校

(同济大学附属同济医院检验科，上海 200065)

外泌体是直径为50～200 nm，由脂质双层膜包裹的纳米级细胞外囊泡，广泛存在于血液、尿液、淋巴液、精液、乳汁、唾液等体液中。外泌体可作为载体携带蛋白质、核酸[DNA、mRNA、miRNA、长链非编码RNA(lncRNA)等]和脂类等物质，可通过直接的膜融合作用、内吞作用、吞噬作用和配体/受体的相互作用将其相关成分转移到靶细胞，从而发挥相应的生物学功能[1]。近年来研究表明，lncRNA可被外泌体携带，广泛参与细胞间物质交换与信号转导并稳定地存在于体液中，且不受内源性RNA酶对其降解的影响[2]。深入分析外泌体lncRNA在肿瘤中的临床应用，将为肿瘤的早期诊断、治疗监测和预后评估等提供新的生物标志物。

1 外泌体lncRNA概述

lncRNA是一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA，缺乏完整的开放阅读框，不具有编码蛋白能力，或编码功能受限。lncRNA可调控基因组在转录、转录后、表观遗传学方面的表达，参与染色质修饰，转录激活与抑制，基因组印记修饰，核内运输，mRNA剪切和降解等调控过程，并与多种疾病，尤其是肿瘤的发生、发展、治疗等密切相关[3]。目前，已有大量研究结果证明，病理状态下，尤其是肿瘤疾病，许多外泌体lncRNA与正常对照样本中的表达水平具有明显差异，这说明外泌体能够选择性地包装、分泌和转移特定lncRNA，并发挥相应的生物学功能[2]。外泌体lncRNA研究是肿瘤生物学的重要部分，可参与肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移、血管生成等环节，在药物抵抗和免疫抑制微环境等方面也具有重要作用[2]。外泌体lncRNA可来源于肿瘤细胞、肿瘤相关巨噬细胞和成纤维细胞，通过恶性细胞和非转化细胞间的信号传递作用于特定靶细胞，改变肿瘤微环境，促进肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移；另外，外泌体lncRNA被证明可调节抗原呈递，影响免疫细胞的活性，并诱导相关效应细胞的凋亡[4]。由于外泌体lncRNA的上述特性，目前普遍认为其可作为肿瘤早期诊断、疗效监测和预后评估的新型生物标志物。

2 外泌体lncRNA的临床应用

目前，临床上常用的肿瘤生物标志物主要是肿瘤抗原和异位激素，虽然传统生物标志物在肿瘤早期诊断中的应用比较广泛，但其存在诸多不足，包括灵敏度低、特异性差，且同一种生物标志物可能预示多种癌症风险，存在较大的漏诊和误诊概率。因此，寻找敏感、特异、无创的肿瘤生物标志物，对肿瘤的早期诊断、治疗监测和预后评估等均具有重要意义。近年来，随着液体活检的深入研究，发现外泌体lncRNA是最有潜力的液体活检生物标志物之一。通过分析癌原性外泌体携带的lncRNA，可以直接获取更多肿瘤学信息，协助肿瘤的早期诊断、治疗监测和预后评估等[5]。

2.1外泌体lncRNA在神经系统肿瘤诊断中的应用 神经胶质瘤和胶质母细胞瘤是神经系统最常见的肿瘤，研究显示，外泌体lncRNA在神经系统肿瘤诊断中具有潜在应用价值[6-8]。王博等[6]通过对82例神经胶质瘤患者和80例健康对照者血浆外泌体lncRNA LINC00511的表达进行检测，发现其在神经胶质瘤患者血浆外泌体中表达上调，并与临床特征及预后密切相关。另外，有研究发现，血清外泌体中的lncRNA HOTAIR和SBF2-AS1可作为胶质母细胞瘤诊断和预后评估的生物标志物[7-8]，见表1。

表1 外泌体lncRNA在神经系统肿瘤诊断中的应用

2.2外泌体lncRNA在消化系统肿瘤诊断中的应用 消化系统肿瘤主要包括胃癌、胆囊癌、肝癌、结直肠癌和胰腺癌，其发病率和病死率均较高。ZHAO等[9]通过检测126例胃癌患者和120例健康对照者血清外泌体lncRNA HOTTIP的表达水平，结果发现，胃癌患者组表达水平明显高于健康对照组，并与肿瘤浸润和TNM分期显著相关，对胃癌的诊断效能明显高于血清学标志物[癌胚抗原、糖类抗原(CA)19-9和CA72-4]，是胃癌预后的独立危险因子。因此，外泌体lncRNA HOTTIP是胃癌诊断和预后评估的潜在生物标志物。XU等[10]通过检测60例肝癌、85例肝硬化、96例慢性乙型肝炎患者和60例健康对照者血清ENSG00000258332.1和LINC00635的表达水平，发现肝癌患者血清中两种lncRNAs表达水平均明显高于其他组，且与门静脉栓塞、淋巴结转移、TNM分期和总生存期相关；通过一项独立队列研究发现，ENSG00000258332.1、LINC00635与甲胎蛋白联合诊断肝癌具有更高的灵敏度与特异度[10]。HU等[11]采用微阵列分析了50例结直肠癌患者和50例健康对照者血浆外泌体lncRNA表达谱，并采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测表达水平，结果表明，患者血浆中有6种lncRNAs (LNCV6_116109、LNCV6_98390、LNCV6_38772、LNCV_108266、LNCV6_84003、LNCV6_98602)的表达水平较健康个体明显上调，可能成为结直肠癌早期诊断的生物标志物。GE等[12]通过对胆管癌患者胆汁外泌体lncRNAs测序、GO分析、KEGG pathway和共表达分析，以及ROC曲线和生存分析发现，与对照组比较，ENST00000588480.1和ENST00000517758.1表达水平明显增加，二者具有成为诊断标志物和治疗靶点的潜在应用价值。任潇凡等[13]通过检测66例胰腺癌患者及66例健康对照者血清中外泌体lncRNA CCAT1表达水平，发现该lncRNA在胰腺癌患者外泌体中高表达，在胰腺癌的早期诊断中比CA19-9具有更高的灵敏度、特异度和准确性，并且与TNM分期和患者生存期有关，可作为预测胰腺癌患者不良预后的独立因素。综上所述，外泌体lncRNA在消化系统各类常见肿瘤，如胃癌、结直肠癌、肝癌等肿瘤患者中的表达水平与正常对照者比较有明显差异，具有作为疾病诊断、预后评估等生物标志物的潜能，见表2。

表2 外泌体lncRNA在消化系统肿瘤诊断中的应用

2.3外泌体lncRNA在生殖系统肿瘤诊断中的应用 近几年女性生殖系统肿瘤发病率急剧上升，并呈年轻化趋势，严重威胁女性的健康。研究表明，外泌体lncRNA可作为卵巢癌、宫颈癌、乳腺癌的早期诊断和预后评估标志物[40-44]。QIU等[40]研究发现，lncRNA MALAT-1在卵巢癌患者血清外泌体中呈高表达，且与肿瘤的进展和转移高度相关，是卵巢癌总生存期的独立预测因子。TANG等[41]研究发现，卵巢癌患者血清外泌体中aHIF表达水平升高，Kaplan-Meier生存分析显示，血清外泌体aHIF表达水平较高的患者总体生存率较差。因此，aHIF被认为是卵巢癌不良预后的独立因素。ZHANG等[42]通过定量检测宫颈癌患者和健康对照者阴道灌洗液中外泌体lncRNAs HOTAIR、MALAT-1和MEG3表达水平，发现与正常对照者相比，3种lncRNAs富集于宫颈癌患者外泌体中，可作为宫颈癌诊断的生物标志物。ZHONG等[43]通过qRT-PCR检测H19在乳腺癌患者及健康对照者血清外泌体中的表达水平，发现其在乳腺癌患者中表达水平明显上调，患者术后H19的中位表达水平明显低于术前；此外，外泌体H19表达水平与转移、TNM分期相关，是一种新的乳腺癌诊断标志物。WANG等[44]的研究表明，血浆外泌体lnc RNA HOTAIR的表达与肿瘤组织中受体酪氨酸激酶ErbB2的表达呈正相关，可为开发新的液体活检生物标志物和提高乳腺癌靶向治疗效果提供分子基础。见表3。

2.4外泌体lncRNA在泌尿系统肿瘤诊断中的应用 泌尿系统肿瘤主要包括前列腺癌、膀胱癌、肾癌、尿路上皮癌、阴茎癌、睾丸癌等。大量研究表明，血液或尿液中外泌体lncRNA是一种便捷、无创的泌尿系统肿瘤早期诊断及预后评估的新型标志物[45-53]。ISIN等[45]通过比较30例前列腺癌患者和49例良性前列腺增生患者尿液外泌体lncRNA-p21和GAS5的表达水平，观察到前列腺癌和前列腺增生患者的外泌体lncRNA-p21表达水平有明显差异，而GAS5表达水平无明显差异，表明外泌体lncRNA-p21可作为评估前列腺癌患者恶性状态的标志物。研究人员通过RNA测序来鉴定尿路上皮细胞癌患者尿液中富集的lncRNA，结果表明，尿液来源的lncRNA可作为生物标志物和治疗靶点[46]。WANG等[46]的研究发现，与健康对照者及膀胱良性疾病患者相比，外泌体lncRNA H19富集于膀胱癌患者血清外泌体中，生存曲线分析显示，膀胱癌患者血清外泌体H19水平越高，预后越差，认为血清外泌体H19可作为判断膀胱癌患者预后的标志物。QU等[47]研究发现，lncRNA ARSR可作为外泌体的一部分被传递给舒尼替尼敏感的肾癌细胞，导致舒尼替尼耐药，可作为肾癌预测耐药的指标和潜在的治疗靶点。多种lncRNA参与前列腺癌和膀胱癌的发生和发展，并可在尿液和血液中被检出，可作为诊断、预后评估和预测耐药的标志物。见表4。

2.5外泌体lncRNA在呼吸系统肿瘤诊断中的应用 肺癌是发病率和病死率增长最快、对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。研究表明，外泌体lncRNA对肺癌的早期诊断具有重要临床意义。ZANG等[54]通过qRT-PCR检测非小细胞肺癌(NSCLC)患者肿瘤组织、血清和血清外泌体中UFC1的表达水平，发现NSCLC患者肿瘤组织、血清、血清外泌体中UFC1表达水平均上调，且高水平的UFC1与肿瘤浸润有关，认为UFC1是诊断NSCLC的潜在标志物。TAO等[55]对NSCLC患者和健康对照者的血清外泌体lncRNA进行定量分析，发现SOX2OT、TBILA和AGAP2-AS1表达水平明显上调，其中TBILA和AGAP2-AS1对早期NSCLC患者具有更好的诊断效率，且这两种外泌体lncRNAs与临床广泛应用的血清肿瘤生物标志物(CA21-1)联合使用，能够进一步提高NSCLC患者诊断的准确性。LI等[56]对64例NSCLC患者和40例健康者进行血清外泌体GAS5定量分析，结果表明，与健康对照组相比，NSCLC患者GAS5表达水平下调，此外，其低表达与肿瘤体积及TNM分期相关。因此，GAS5可作为NSCLC早期诊断的标志物。ZHANG等[57]研究发现，外泌体MALAT-1在NSCLC患者中呈高表达，尤其是外泌体MALAT-1的表达水平与肿瘤分期和淋巴转移均呈正相关，可作为NSCLC诊断和预后评估的液体活检标志物。见表5。

表3 外泌体lncRNA在生殖系统肿瘤诊断中的应用

表4 外泌体lncRNA在泌尿系统肿瘤诊断中的应用

表5 外泌体lncRNA在NSCLC诊断中的应用

3 外泌体lncRNA检测面临的挑战

在外泌体lncRNA的研究中，制备高纯度外泌体是后续试验中至关重要的一步，是试验结果可靠的基础。已有多种方法和技术可用于外泌体的分离、鉴定及lncRNA的检测，但研究人员也面临一系列重大挑战。目前，外泌体lncRNA检测面临的挑战主要表现在以下几个方面：(1)虽然现在不断推出新的外泌体提取试剂盒，操作步骤也越来越简便、快速，但总体来说获得的产物纯度依然较低，现有的外泌体提取方法仍存在一定的缺陷，缺乏统一规范的标准化操作步骤，造成各实验室之间检测结果差异较大，因此，暂不适合于临床大规模开展；(2)qRT-PCR检测lncRNA应用广泛，为验证的金标准，可定量，操作简便，成本低廉，但受到低通量的局限性；(3)RNA微阵列芯片检测lncRNA具有高通量的优势，但成本高、数据处理复杂；(4)RNA测序技术具有高通量的优势，但不能满足检测单个基因的要求，检测成本较高；(5)lncRNA的内参基因不统一，目前无法确定选取何种基因作为内参是稳定的，以及如何用合适的内参基因来计算循环lncRNA的表达。另外，对于外泌体lncRNA在肿瘤发生和发展中的作用及机制研究有待深入探索，选取作为生物标志物的外泌体lncRNA应具有检测的高灵敏度和强特异度，在体液中的丰度应较高，而目前研究发现的一些lncRNAs，如H19、HOTAIR、MALAT-1等在多种肿瘤中呈高表达，其作为诊断标志物的特异度有待进一步提升，并且还应保证lncRNA在外泌体内稳定存在，必要时还要验证其稳定性，满足临床检测的要求。人体肿瘤细胞和正常细胞都能分泌外泌体，但是目前尚无特异性的标志物来区分外泌体的来源，因此，如何避免正常细胞分泌的外泌体产生的干扰，分离肿瘤特异性外泌体也是面临的一大挑战。

4 总结与展望

病理活检作为传统肿瘤诊断的金标准具有一定局限性，活检取材对患者有创，具有一定的危险性，包括出血、肿瘤播散等，也不利于重复检测和纵向监测；另外，病理活检取材范围局限，只能留取病变部位的一小块组织，而肿瘤病变具有异质性，因此，不利于准确、全面地掌握疾病信息。近年来，外泌体lncRNA作为一种无创伤、特异和敏感的肿瘤标志物越来越受到人们的重视。外泌体lncRNA检测多采用血清或血浆标本进行液体活检，具有无创、可重复检测、实时监测等优势，联合影像学资料及传统的肿瘤标志物检测，有望实现对肿瘤的早期诊断、复发监测、预后判断和疗效评估。目前，外泌体的分离提取、鉴定及lncRNA检测技术尚需不断优化，建立统一规范的标准化操作程序，对推动外泌体检测在临床上的应用具有重要意义。考虑到外泌体的来源是异质性的，分泌到肿瘤中的外泌体具有多种亚型，外泌体亚型及外泌体对lncRNA的选择性包装、分泌和转移机制都需要深入探索，以确保未来临床应用的准确性。目前，外泌体lncRNA检测技术还存在一定的局限性，那么对现有技术的改进及新技术的开发与应用就十分有必要。网络数字模型、生物传感器、人工智能等技术的联合应用，将为外泌体lncRNA检测技术带来一场新的革命。随着外泌体lncRNA的基础理论和应用研究的不断深入，外泌体lncRNA除了作为疾病早期诊断、治疗监测和预后评估等生物标志物外，还可作为肿瘤的治疗靶点，为肿瘤的精准诊疗提供一个新的方向。因此，外泌体lncRNA在肿瘤诊疗领域将具有广阔的应用前景。