血清谷胱甘肽还原酶活性水平评估乙型肝炎肝损伤患者的临床价值*

李淑丽，陆善词，王 军，杨海辉，何 娟，梁连辉，高文军

(广东省中山市第二人民医院：1.检验科；2.医教科；3.肝病科，广东中山 528447)

肝脏疾病包括甲型肝炎、乙型肝炎(简称乙肝)、丙型肝炎(简称丙肝)、肝硬化、脂肪肝、肝癌、酒精肝等多种形式[1]，是一种常见的危害性极大的疾病，肝损伤是这类疾病的主要临床表现之一[2]。谷胱甘肽是一种细胞内关键的抗氧化剂，在代谢清除亲电异源性物质的生理活动中起重要作用[3]。谷胱甘肽还原酶(GR)可催化氧化型谷胱甘肽(GSSG)转变成还原型谷胱甘肽(GSH)，保持机体内GSH处于高水平，维持体内适当还原态环境[4-7]。有研究表明，在多种肝脏疾病中，尤其是传染性肝病、急性肝炎的初始阶段、肝硬化及涉及肝脏转移的恶性病变中，患者血清GR活性水平均明显升高[8-9]。此外，在不同临床环境中，GR与其他肝源型酶蛋白，如丙氨酸氨基转移酶(ALT)和碱性磷酸酶(ALP)等，在体内的水平有明显差异。动物模型和临床试验均证实，GSH对肝损伤有保护和修复作用[10-11]。因此，GR可作为肝损伤程度的评估指标，检测血清中GR活性水平有助于辅助诊断、治疗各类肝病，评估肝损伤程度，监测治疗效果，为现有常规肝功能检测指标提供补充。本研究以临床确诊的乙肝患者为肝损伤模型，以自建检测体系调查血清GR活性水平在表观健康人群与肝损伤个体中的变化趋势及其与其他常规肝功能检测项目的关联性和差异性，为临床应用GR辅助诊断、治疗各类肝病，评估肝损伤程度提供依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年3月至2019年4月在本院确诊的606例乙肝患者作为肝损伤组，其中男472例，女134例，年龄18～83岁。另选取同期本院体检中心表观健康人群430例作为对照组，其中男205例，女225例，年龄18～83岁。所有研究对象均自愿参与本研究并签署知情同意书。

1.2纳入和排除标准

1.2.1对照组纳入标准 所有入选者年龄均大于或等于18岁；肝功能检测无异常，结果处于正常参考区间内，ALT：5～40 U/L，天门冬氨酸氨基转移酶(AST)：0～40 U/L，总胆红素(TBIL)：1.7～26.0 μmol/L，ALP：40～150 U/L；乙肝5项检查结果中乙肝表面抗原(HBsAg)为阴性；丙肝病毒抗体(HCV-IgG)检测结果为阴性。

1.2.2肝损伤组纳入标准 所有入选者年龄均大于或等于18岁；乙肝5项检查结果中HBsAg为阳性，其他4项不作要求。HCV-IgG检测结果为阴性。

1.3方法

1.3.1标本采集 采集所有研究对象空腹静脉血3 mL，2 h内离心并分离血清，24 h内进行检测的标本可冷藏(2～8 ℃)保存。24 h内无法测定的标本需冷冻(-20 ℃或以下)保存，不能反复冻融，冷冻保存的标本最多保存6个月。血清标本体积不少于1 mL。

1.3.2生化指标检测 血清GR活性水平采用GSSG底物法检测，试剂盒由上海润鸿生物科技有限公司提供，检测仪器为HITACHI 7180全自动生化分析仪(日本日立公司)。ALT、AST、TBIL和ALP试剂盒由上海执诚生化科技有限公司提供，检测仪器为日立7180全自动生化分析仪(日本日立公司)或SIEMENS ADVIA1800全自动生化分析仪(德国西门子公司)。乙肝5项采用cobas e411全自动电化学发光分析仪(瑞士罗氏公司)及配套试剂检测。HCV-IgG采用酶联免疫吸附试验检测，试剂盒购自北京万泰生物药业股份有限公司，检测仪器为BioTek ELX80酶标仪(美国宝特公司)。

2 结 果

2.1对照组与肝损伤组各项生化指标测定结果比较 见表1。对照组和肝损伤组(总体和不同性别分组)研究对象年龄、ALT、AST、TBIL、ALP和GR检测结果均呈非正态分布。对照组与肝损伤组总体比较，肝损伤组研究对象年龄中位数为38.0岁，高于对照组的35.0岁，差异有统计学意义(P<0.05)。肝损伤组各项生化指标检测结果均高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.001)，其中肝损伤组总体血清GR活性水平为74.0(62.8～99.0)U/L，明显高于对照组的52.0(47.0～56.0)U/L(图1)。对照组男性ALT、AST、TBIL、ALP和GR的检测结果与女性比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，其中男性GR活性水平中位数为53.0 U/L，高于女性的51.0 U/L,差异有统计学意义(P<0.05)。肝损伤组男性仅TBIL和ALP检测结果与女性差异有统计学意义(P<0.001)，其他检测结果差异均无统计学意义(P>0.05)。

表1 对照组与肝损伤组各项生化指标测定结果比较[M(P25～P75)]

图1 两组GR活性水平比较

2.2GR活性水平与其他肝源性生物标志物相关性分析 以1 036例研究对象血清GR活性水平为因变量，年龄、ALT、AST、TBIL和ALP为自变量进行多重线性回归分析，构建线性回归方程为：Y=33.267X+0.306×年龄+0.038×ALT+0.017×AST+0.004×TBIL+0.186×ALP(表2)，相关系数r2=0.383。Durbin-Watson检验值为1.820，说明数据间相互独立。ANOVA分析模型差异有统计学意义(F=127.923，P<0.001)。由表2可见，ALT和ALP的标准化回归系数分别为0.331和0.319，说明ALT和ALP对GR活性水平的影响最大；年龄和AST对GR活性水平的影响较小；而TBIL的回归系数差异无统计学意义(P=0.119)，说明TBIL水平对GR的活性水平无影响，二者不相关。

2.3肝损伤个体中独立危险因子的单因素和多因素二分类Logistic回归分析 以乙肝临床诊断为因变量，年龄、ALT、AST、TBIL、ALP和GR为自变量进行单因素二分类Logistic回归分析显示，除年龄外，ALT、AST、TBIL、ALP和GR均为肝损伤的独立危险因子。选取除年龄外的其他自变量进一步进行多因素二分类Logistic回归分析可见，ALT水平升高，比值比(OR)=1.449，95%置信区间(CI)：1.306～1.609(P<0.001)；AST水平升高(OR=1.220，95%CI：1.102～1.351，P<0.001)；TBIL水平升高(OR=1.473，95%CI：1.302～1.666，P<0.001)；GR活性水平升高(OR=1.086，95%CI：1.041～1.134，P<0.001)。ALT、AST、TBIL、GR均为由乙肝引起的肝损伤的独立危险因子(表3)。

表2 多重线性分析结果

2.4GR活性水平的ROC曲线分析及比较 对ALT、AST、TBIL、ALP和GR进行ROC曲线分析可知，血清GR活性水平对乙肝患者肝损伤的诊断界值为59.5 U/L，AUC为0.899(95%CI:0.881～0.918，P<0.001)，灵敏度为82.7%，特异度为85.3%(图2)。对不同因子的ROC曲线进行比较，ALT和AST的AUC最大，分别为0.984和0.977，诊断效能最大，二者间差异无统计学意义(P>0.05)。TBIL和ALP的AUC分别为0.783和0.818，二者间差异无统计学意义(P>0.05)。GR与其他因子的AUC比较,差异均有统计学意义(P<0.05)，诊断效能次于ALT和AST，但优于TBIL和ALP(表4)。

表3 单因素和多因素回归分析

表4 不同因子的AUC比较

图2 不同因子的ROC曲线

3 讨 论

肝脏在有机体的代谢和排毒过程中起关键作用。药物、内源性或异源性物质等多种因素均会引起氧化应激反应，产生自由基，导致肝损伤[12]。GSH在肝脏的亲电物质转运系统中起重要作用，而谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)和GR参与调节和维持GSH微循环，清除自由基和过氧化物，抵御各类疾病、内源性和外源性侵入[13]。有研究表明，肝损伤患者血清和肝脏中GR活性水平均明显升高，且上升早于血清ALP，其生理过程可能为：肝损伤时，细胞膜的渗透能力发生变化，导致GR随ALT等其他肝源性酶一同从这些组织内释放至血液中[9]。进一步研究确认，肝损伤过程中的氧化应激反应导致血清中GR活性水平上升[12]。在由四氯化碳诱导的肝损伤动物模型中，氧化应激反应促使细胞产生自由基，损害肝脏；而机体自身的抗氧化保护系统被激活以消除自由基带来的损伤，在该系统中，GPx借助GSH传递电子消除有机物或无机过氧化物生成GSSG，而GR则将GSSG还原为GSH循环利用[14]，机体自身通过增加GPx和GR活性水平改善体内的氧化还原环境，从而消除有害环境的影响。

本研究结果显示：(1)在由乙肝诱导的肝损伤个体中，血清GR活性水平明显高于表观健康人群，差异有统计学意义(P<0.001)。按性别统计，肝损伤组男性与女性血清GR活性水平均高于对照组。前期本研究组已报道，在表观健康人群中，男性血清GR活性水平明显高于女性，分别为39～72 U/L和41～65 U/L[15]。本研究中肝损伤组男、女性不存在差异，这可能是由于在临床实践中，男性肝炎患者数量明显多于女性，导致女性研究对象占比较少(22.1%)，未体现出差异。(2)ALT主要存在于肝细胞细胞质中，当肝损伤时，只要1%的肝细胞发生坏死，血清ALT水平急剧升高，是最敏感的肝源性生物标志物。ALP主要存在于肝细胞血窦侧肝窦状隙表面，在急、慢性肝炎时血清ALP水平呈轻度或中度上升。通过多因素线性回归分析可知，GR与ALT和ALP的标准化回归系数分别为0.331和0.319，说明ALT和ALP与GR均呈正相关，且对GR活性水平影响较大。该研究结果间接说明，GR与ALT一样，在肝损伤初期，细胞膜通透性增强时，自肝细胞释放至血清中。同时，与ALT和ALP的强相关性也可说明，血清GR活性水平升高是由肝损伤导致的。GR与AST呈弱相关(r=0.113)，与TBIL无相关性，说明GR具有独立性，可为现有常规肝功能检测指标提供补充，且不受年龄影响。(3)二分类Logistic回归分析结果显示，血清ALT、AST和GR活性水平升高在单因素和多因素回归分析中均是由乙肝引起的肝损伤独立危险因子，其中血清GR活性水平每增加1 U/L，肝损伤的风险升高1.086倍。而ALP水平升高在多因素回归分析中不是独立的危险因子，这可能是由于ALP的代谢释放机制不同，ALP经胆管排泄，肝损伤时，肝细胞对其摄取发生功能异常，从而使ALP在脂膜上渗透进入血液循环。(4)ROC曲线分析结果显示，血清GR活性水平对乙肝患者肝损伤的诊断界值为59.5 U/L，与近年报道的参考区间有重叠[15]，在临床实践中应结合其他生物标志物综合考量，并在后续研究中进一步优化。血清GR活性水平的AUC为0.899，灵敏度为82.7%，特异度为85.3%，诊断效能次于ALT和AST，但优于TBIL和ALP。

4 结 论

本研究证实，血清GR活性水平升高与乙肝引起的肝损伤明显相关，检测血清GR活性水平可作为辅助诊断、治疗各类肝病，评估肝损伤程度的方法。但需要指出的是，本研究仅采用了常见的由乙肝引起的肝损伤个体作为研究对象，未考虑其他肝脏疾病类型，需在后续研究中进一步验证其临床价值。