广西地区葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的分子流行病学分析*

俸诗瀚，耿国兴，阳 奇，黄丽梅，李孟婷，易 升，韦 媛，蓝月云，欧阳鲁平△

(1.广西壮族自治区妇幼保健院遗传代谢中心实验室，广西南宁 530003；2.广西医科大学第二附属医院遗传与基因组医学中心，广西南宁 530007)

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症在我国分布的特点主要呈“南高北低”，以广西、广东、海南、贵州、云南、四川等地区最为普遍，当前调查研究称广西地区的携带率大约为7.4%，而有个别省份的人群基因携带率接近16.0%[1-3]。当前用于检测G6PD缺乏症的方法较多,而WHO推荐的G6PD/6PGD比值法因其具有操作简单、结果可靠性高及可检出杂合子的优点，目前为国际公认的检测方法[4-6]。G6PD缺乏的致病基因主要位于X染色体长臂2区8带,依照X连锁不完全显性的遗传方式，基因全长20 114 bp,主要由13个外显子和12个内含子共同组成,可编码515个氨基酸[7]。本研究对广西地区457例疑似G6PD缺乏症患儿同时进行G6PD/6PGD比值法酶活性检测和基因突变检测，以此判断结果的吻合情况和广西地区基因携带情况。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2016-2017年来广西壮族自治区妇幼保健院门诊就诊的疑似G6PD缺乏患儿及新生儿疾病筛查G6PD酶活性初筛阳性的新生儿共457例作为研究对象,其中G6PD缺乏症患儿431例。

1.2仪器与试剂

1.2.1仪器 LWC200i全自动生化分析仪;Lab-Aid核酸自动提取仪;BIO-RADC1000 PCR 基因扩增仪;ABI3500基因测序仪。

1.2.2试剂盒 广州米基医疗器械有限公司改良版G6PD测定试剂盒(定量比值法)；致善生物科技公司Lab-Aid基因组DNA分离试剂盒;康为试剂公司2*ES Tap Master Mix试剂盒;DNA测序：引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，通过一代基因测序技术Sanger法对DNA片段进行测序分析。

1.3研究方法

1.3.1方法 采集静脉抗凝血，按照试剂说明书操作。结果判断：G6PD/6PGD比值法G6PD酶活性缺乏<1.0(正常值1.0～2.5)。

1.3.2DNA提取 DNA提取参照致善生物科技公司Lab-Aid基因组DNA分离试剂盒的提取方法。

1.3.3基因突变检测 设计G6PD引物，根据NCBI序列，利用Oligo7设计引物，扩增产物200～650 bp，其中E3-4、E5-6、E9-10、E11-12合并扩增。PCR扩增体系为25 μL，2×Master Mix 12.5 μL，上、下游引物0.5 μL，DNA溶液2 μL，水9.5 μL。扩增结束后，取3 μLPCR产物在 1% 琼脂糖凝胶上电泳，100 V，40 min；电泳结束后取下用凝胶成像仪成像检测，鉴定为本研究所需DNA片段后送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.4统计学处理 采用SPSS22.0统计软件进行数据分析处理。

2 结 果

在门诊随访的457例疑似患儿均采用G6PD/6PGD比值法进行酶活性检测，其中G6PD/6PGD<1.0,即酶活性降低391例，G6PD/6PGD≥1.0～2.5，即酶活性正常66例。G6PD基因检测，酶活性降低的391例疑似患儿均为G6PD基因致病突变携带者；而在酶活性正常的66例疑似患儿中，也检测到40例携带有杂合致病性突变的患儿,均为女性。本研究中G6PD基因突变分布情况：95 A>G 74例(17.17%)，871 G>A 32例(7.42%)，1 024 C>T 28例(6.50%)，1 376 G>T 123例(28.54%)，1 388 G>A 156例(36.19%)，其余位点突变18例(4.18%)，见表1。两种方法检测457例G6PD疑似患儿检出率见表2。

表1 431例G6PD缺乏症患儿基因位点统计

表2 两种方法检测457例G6PD疑似患儿检出率比较

3 讨 论

G6PD缺乏症是依据伴性不完全显性遗传,一般男性发病率较高,这是因为男性(核型46，XY)只有1条X染色体,当这条X染色体携带上G6PD缺乏症的致病基因时,其酶活性明显缺乏,称为半合子;而女性(核型46，XX)不同，因其具有2条X染色体,其中某1条X染色体携带有G6PD缺乏症的致病基因,但是剩下的另1条X染色体正常,可造成体内形成两类红细胞的“嵌合体”,称为杂合子，这类女性携带者则称为G6PD缺乏症基因携带者,携带者的酶活性变化范围较大,有些人可表现为正常,有些人则表现为半合子水平状态;当女性2条X染色体都携带上G6PD缺乏症致病基因时,就可称其为纯合子,其酶活性一般表现为中度或重度缺乏。纯合子虽然不常见,但是依然可以发病[8]。

本研究发现，在457例(男305例，女152例)疑似患儿中，G6PD/6PGD比值法检测出阳性391例，男292例(95.74%)，女99例(65.13%)，Sanger法检测检出阳性431例,男292例(95.74%)，女139例(91.45%)。G6PD/6PGD比值法检出的391例酶活性异常疑似患儿结果与基因突变检测结果相符，见表2，均可找到基因突变位点；而在酶活性正常的66例疑似患儿中，也发现致病性杂合突变携带者40例，均为女性，这部分患儿均数±标准差为1.19±0.16，可见G6PD/6PGD比值法测定只是一种表型诊断，会因为各种因素漏诊一部分杂合子女性[9-10]。因此，当女性G6PD常规筛查检测结果正常，但仍出现G6PD缺乏的临床症状时，建议做基因突变检测，以进一步确诊是否携带G6PD致病基因。

G6PD变异有明显的群体或地域方面的特异性，一般表现为某个群体或部族主要以某一种或几种突变类型为主，如地中海沿岸国家多以563 C>T为主，非洲国家则多为202 G>A/c.376 A>G，而老挝、柬埔寨等东南亚国家基本上是以871 G>A/c.1 311 C>T为主，印度尼西亚的安汶人群多数为383 T>C，以上这些突变可能是较古老的突变。1 388 G>A、1 376 G>T和95 A>G是我国排前3的G6PD基因突变类型，目前这3类突变频率之和占所有类型的70%以上，且仅在华人中存在[11-12]。在本次基因检测发现，广西地区热点突变为：95 A>G 74例(17.17%)，871 G>A32例(7.42%)，1 024 C>T 28例(6.50%)，1 376 G>T 123例(28.54%)，1 388 G>A 156例(36.19%)，其余位点突变18例(4.18%)。1 388 G>A、1 376 G>T和95 A>G最为常见，其次是871 G>A，约占7.42%，该突变位点是泰国、越南、老挝、柬埔寨等东南亚国家的主要突变类型，有很高的发生率，我国其他地方也少有871 G>A的报道[13-15]。

通过G6PD/6PGD比值法与Sanger法基因突变检测结果对比分析显示，G6PD/6PGD比值法酶活性降低的疑似患儿与Sanger法基因突变检测结果吻合率为100%，而酶活性正常的疑似患儿与基因突变检测结果吻合率只有40%，这些未检测出的患儿均为女性携带者，归因于G6PD为伴X遗传，存在随机失活现象，出现部分杂合子突变患儿比值法酶活性高于切值，但仍携带有致病性突变。因此，采用分子诊断方法可有效检测出女性杂合子。

综上所述，广西地区G6PD基因突变类型既有中国人群普遍代表性，又有广西本地区人群G6PD基因突变的特征。基因分子水平检测明显提高了女性杂合子G6PD缺乏症的检出率，解决了女性杂合子G6PD缺乏症漏检情况发生。