蟾酥适宜初加工方法研究△

罗毅，范圣此，和飞，李秀凤，孟兆青

山东宏济堂制药集团股份有限公司，山东 济南 250103

蟾酥为蟾蜍科动物中华大蟾蜍BufobufogargarizansCantor或黑眶蟾蜍B.melanostictusSchneider的耳后腺和皮肤腺的干燥分泌物，是我国传统名贵中药材。多于夏、秋两季捕捉蟾蜍，洗净，挤取耳后腺和皮肤腺的白色浆液，加工，干燥[1]。

目前，蟾酥商品质量参差不齐，初加工的不规范是导致蟾酥药材质量千差万别的主要原因之一。蟾酥初加工方法研究已有一些报道，如：冷冻干燥、阴干、晒干、鼓风干燥等[2-5]。通过实地调研发现，蟾酥的道地主产区(临沂)的初加工方法是在17 ℃空调室内利用风扇避光干燥。《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)未规定应用何种干燥方法和干燥时间，但不同的干燥方法，导致蟾酥的样品外观色泽(深黄色、黄色、浅黄色、白色)和化学成分的含量及组成比例存在较大差异，严重影响了蟾酥药材质量和临床疗效。基于此，本研究采用8种不同的干燥方法(17 ℃风干、60 ℃烘干、80 ℃烘干、105 ℃烘干、120 ℃烘干、阴干、晒干、冷冻干燥)处理鲜蟾酥样品，通过观察干蟾酥的外观色泽并利用HPLC对干蟾酥的沙蟾毒精、远华蟾毒精、蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基6种成分进行测定，确定蟾酥适宜的初加工方法，为蟾酥的初加工规范化提供理论依据。

1 材料

Agilent 1260高效液相系统；万分之一电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；pH计(梅特勒-托利多仪器有限公司)。

沙蟾毒精对照品(批号：20180945,纯度>99.0%)、远华蟾毒精对照品(批号：20181089,纯度>98.0%)、蟾毒它灵对照品(批号：20180314,纯度>99.0%)、蟾毒灵对照品(批号：111981-201501,纯度>98.0%)均购于天津万象恒远科技有限公司；华蟾酥毒基对照品(批号：110803-201406,纯度>99.6%)、酯蟾毒配基对照品(批号：110718-201108,纯度>98.0%)均购于中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯；水为超纯水；其余试剂为分析纯。

鲜蟾酥样品采于临沂费县，由山东中医药大学林桂涛教授鉴定为蟾蜍科动物中华大蟾蜍B.bufogargarizansCantor耳后腺和皮肤腺分泌的白色浆液。

2 方法和结果

2.1 样品制备

蟾酥鲜浆用60目筛过滤，去除杂质，然后用药勺将鲜浆转移至模具中，按照不同的干燥方法(17 ℃风干、60 ℃烘干、80 ℃烘干、105 ℃烘干、120 ℃烘干、阴干、晒干、冷冻干燥)进行干燥，每隔一段时间进行称量，至连续2次称量质量不再变化为止，制成直径20 mm，高约7 mm规格的圆饼状蟾酥。

2.2 蟾酥外观色泽

蟾酥鲜浆经过不同的干燥方法(17 ℃风干、60 ℃烘干、80 ℃烘干、105 ℃烘干、120 ℃烘干、阴干、晒干、冷冻干燥)制成的饼状蟾酥及其粉碎成细粉外观色泽出现明显的差异(见图1)。鲜浆未经过加工呈现灰白色，膏体状态。经过冷冻干燥后的蟾酥为灰白色的粉末状态，而其他加工后的蟾酥为褐色的块状。蟾酥粉粹后，17 ℃风干、60 ℃烘干、阴干、晒干及冷冻干燥颜色较浅；80 ℃烘干、105 ℃烘干、120 ℃烘干的蟾酥颜色较深，随着温度越高，颜色越深。粉粹后蟾酥的颜色由浅变深变化为：冷冻干燥、晒干、17 ℃风干、阴干、60 ℃烘干、80 ℃烘干、105 ℃烘干、120 ℃烘干。

注：A. 鲜浆；B. 60 ℃烘干的饼状蟾酥；C. 80 ℃烘干的饼状蟾酥；D. 105 ℃烘干的饼状蟾酥；E. 120 ℃烘干的饼状蟾酥；F. 阴干的饼状蟾酥；G. 晒干的饼状蟾酥；H. 冷冻干燥的饼状蟾酥；I. 17 ℃风干的饼状蟾酥；J. 60 ℃烘干的粉碎后细粉；K. 80 ℃烘干的粉碎后细粉；L. 105 ℃烘干的粉碎后细粉；M. 120 ℃烘干的粉碎后细粉；N. 阴干的粉碎后细粉；O. 晒干的粉碎后细粉；P. 冷冻干燥的粉碎后细粉；Q. 17 ℃风干的粉碎后细粉。图1 不同干燥方法饼状蟾酥及粉碎后的细粉

2.3 不同干燥方法的蟾酥样品6种蟾酥内酯类成分含量测定

2.3.1方法学考察

2.3.1.1对照品溶液的制备 精密称取沙蟾毒精、远华蟾毒精、蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、酯蟾毒配基对照品10 mg，置于5 mL量瓶中，加入甲醇制得对照品质量浓度为2 mg·mL-1。精密吸取适量上述6种对照品溶液，加入适量甲醇配置成沙蟾毒精0.045 mg·mL-1、远华蟾毒精0.009 mg·mL-1、蟾毒它灵0.03 mg·mL-1、蟾毒灵0.025 mg·mL-1、华蟾酥毒基0.051 mg·mL-1、酯蟾毒配基0.031 mg·mL-1的混合对照品溶液，备用。

2.3.1.2供试品溶液的制备 精密称定蟾酥细粉25 mg，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇溶液20 mL，称定质量，加热回流提取1 h，放置冷却至室温，再称定质量，用甲醇补充减失的质量，摇匀，0.22 μm滤过，取续滤液，即得。

2.3.1.3色谱条件 采用Alltima C18(250 mm×4.6 mm，5 μm) 色谱柱，流动相为乙腈(A)-0.1%甲酸(B)，梯度洗脱(0～20 min，20%A；20～40 min，30%～35%A；40～60 min，35%～60%A；60～75 min，60%A)；流速0.7 mL·min-1；柱温：25 ℃；检测波长：296 nm；进样量：10 μL。色谱图见图2。

2.3.1.4线性关系考察 以对照品质量浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归处理，得沙蟾毒精、远华蟾毒精、蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基和酯蟾毒配基回归方程，分别为：Y=13 748X+236.06(r=0.999 9)，Y=9 980.3X+34.599(r=0.999 8)，Y=8 447.2X+96.422(r=0.999 9)，Y=11 592X+114.78(r=0.999 5)，Y=15 154X+286.40(r=0.999 9)，Y=8 685.8X+103.36(r=0.999 9)。6种化合物分别在0.010～0.557、0.002～0.090、0.005～0.501、0.005～0.478、0.008～0.914、0.005～0.639 mg·mL-1线性关系良好。

2.3.1.5精密度试验 精密吸取同一混合对照品溶液10 μL，连续进样6次，计算6个峰面积的RSD，沙蟾毒精为0.71%、远华蟾毒精为0.68%、蟾毒它灵为0.64%、蟾毒灵为0.72%、华蟾酥毒基为0.72%、酯蟾毒配基为0.81%，表明精密度良好。

2.3.1.6重复性试验 称取蟾酥粉末约25 mg共6份，精密称定，按供试品溶液处理方法制备样品，测定6个化合物的质量分数的RSD，沙蟾毒精为2.46%、远华蟾毒精为2.15%、蟾毒它灵为2.41%、蟾毒灵为3.22%、华蟾酥毒基为3.10%、酯蟾毒配基为3.09%，表明重复性良好。

注：A.对照品；B.供试品。图2 对照品和蟾酥供试品HPLC图

2.3.1.7稳定性试验 取同一供试品溶液分别于2、4、6、8、12、24 h进行分析，计算6个峰面积的RSD，沙蟾毒精为0.46%、远华蟾毒精为4.24%、蟾毒它灵为0.41%、蟾毒灵为1.47%、华蟾酥毒基为0.17%、酯蟾毒配基为0.72%，表明稳定性良好。

2.3.1.8回收率试验 精密称取适量蟾酥粉末6份，分别加入一定量的对照品，按供试品溶液处理方法制备样品，测定，计算加样回收率。测得6个对照品加样回收率分别为98.24%、99.44%、98.41%、98.37%、99.15%、106.79%，RSD分别为3.37%、3.25%、3.48%、3.26%、3.50%、3.14%。

2.3.2水分测定 按照 《中国药典》第三法测定水分含量，结果见表1。17 ℃风干、60 ℃烘干、阴干、晒干水分为5.99%～6.26%，80 ℃烘干、105 ℃烘干、120 ℃烘干、冷冻干燥水分为5.50%～5.64%。

2.3.3样品测定 取17 ℃风干、60 ℃烘干、80 ℃烘干、105 ℃烘干、120 ℃烘干、阴干、晒干、冷冻干燥加工样品制备供试品溶液，计算沙蟾毒精、远华蟾毒精、蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、酯蟾毒配基的质量分数，每个样品平行3次，质量分数取平均值，结果见表1。6种成分的质量分数是扣除水分得到的实测值。经过比较，8种不同的干燥方法中远华蟾毒精、蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、酯蟾毒配基、蟾酥内酯类的质量分数没有显著变化，沙蟾毒精在17 ℃风干、60 ℃烘干、阴干、晒干、冷冻干燥加工方法中质量分数没有显著变化。但是，沙蟾毒精在60 ℃烘干、80 ℃烘干、105 ℃烘干、120 ℃烘干时，质量分数呈现下降的趋势。

表1 不同蟾酥初加工方法制备品中6种成分质量分数 %

2.4 加工效率指标测定

实验过程中记录每种加工方式从蟾酥鲜浆到恒定质量时的加工时间，以及干燥前后样品的质量，计算干燥后质量与干燥前质量比值，得到样品的折干率。不同加工方法蟾酥干燥加工时间和折干率测定结果见表2。蟾酥鲜浆在17、60、80、105、120 ℃干燥时，随着温度升高，加工时间逐渐缩短。冷冻干燥为2 d，17 ℃风干、阴干、晒干时间较长，分别为15、15、6 d。不同加工方法，蟾酥折干率不同，80 ℃烘干、105 ℃烘干、120 ℃烘干、冷冻干燥折干率在29.64%～31.51%，阴干、晒干、17 ℃风干、60 ℃折干率在32.34%～34.36%。

表2 不同蟾酥初加工方法的加工时间和折干率

3 讨论

蟾酥为国务院颁布的28种毒性中药材之一，也是国家重点保护的二级野生动植物药材品种之一。蟾酥疗效确切、应用广泛，目前市场供不应求，价格不断攀升。但蟾酥的产地加工都是家庭作坊式的，导致蟾酥掺假使杂、浆液种质混杂、灰分超标，很难保证中成药需要的蟾酥原料安全、稳定、有效、可控。

通过不同的干燥方法，除冷冻干燥外，17 ℃风干、60 ℃烘干、80 ℃烘干、105 ℃烘干、120 ℃烘干、阴干、晒干的蟾酥外观性状均符合《中国药典》要求。而冷冻干燥的蟾酥6种化学成分质量分数没有显著的变化，说明冷冻干燥影响蟾酥的外观颜色和状态可能与蛋白质的变性有关。沙蟾毒精为蟾酥中的活性特征成分，具有强心[6]、抗肿瘤作用[7]。其在60 ℃烘干、80 ℃烘干、105 ℃烘干、120 ℃烘干时，质量分数呈现明显下降的趋势，表明沙蟾毒精遇到高温高热易受到破坏。蟾酥粉粹，过筛成细粉，17 ℃风干、60 ℃烘干、阴干、晒干、冷冻干燥蟾酥颜色较浅，80 ℃烘干、105 ℃烘干、120 ℃烘干的蟾酥颜色逐渐加深，因此把蟾酥细粉的颜色作为衡量蟾酥质量好坏的依据值得探讨。

蟾酥不同加工方法折干率为29.64%～34.36%，说明蟾酥鲜浆含水量约70%，这对于蟾酥的加工较为不利。17 ℃风干、阴干、晒干时间较长，会导致微生物的繁殖，造成蟾酥菌检不合格，影响蟾酥的临床应用。本研究中沙蟾毒精的含量较低，对蟾酥中蟾酥内酯类含量贡献较低。然而，有些蟾酥样品中沙蟾毒精质量分数远高于其他蟾毒配基类成分[8]，因此有必要把沙蟾毒精作为蟾酥初加工方法质量控制指标。综合来看，60 ℃热风干燥是蟾酥适宜的加工条件，该加工方法制备的蟾酥质量较佳，蟾酥加工效率较高。本研究结果与曲婷等[2]报道和《山东省中药饮片炮制规范》2012年版中规定60 ℃烘干基本一致[9]。