叙利亚金黄地鼠血管平滑肌细胞的分离、培养及鉴定

李晓杰，覃瑛，周谊霞,2

1贵州医科大学护理学院，贵阳550004；2贵州医科大学附属医院

动脉粥样硬化是心血管疾病致死率、致残率最高的危险因素之一，是缺血性脑卒中、动脉粥样硬化性心脏病、外周血管疾病的主要发病原因[1]。因此，防治动脉粥样硬化是预防心血管病变恶化的重要手段。动脉粥样硬化的发病机制涉及内皮细胞、巨噬细胞、泡沫细胞以及平滑肌细胞等多种细胞的参与，其中平滑肌细胞增殖、迁移、去分化是促进动脉粥样硬化发生的一个关键因素[2]。在正常健康人群中，血管平滑肌细胞处于静止状态[3]；当遇到炎症、脂质含量增多、机械性损伤时，血管平滑肌细胞增殖能力增强，从血管中膜向血管内膜迁移并分泌细胞外基质，使新生血管增多，从而促进了动脉粥样硬化的发生、发展[4]。因此研究血管平滑肌细胞的增殖、迁移对于防治心血管疾病的意义重大。2019年9～12月，本研究建立了一种稳定、可靠的叙利亚金黄地鼠主动脉血管平滑肌细胞的体外培养方法，以期为动脉粥样硬化的基础研究提供可靠的细胞来源。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物： 3～4周龄雄性叙利亚金黄地鼠2只，体质量40～60 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于贵州医科大学动物房[动物使用许可证号：SYXK(黔)2018-0001]。主要试剂：DMEM/F12、青霉素和链霉素、胰蛋白酶均购自美国Gibco公司，特级胎牛血清购自美国Clark公司，PBS购自武汉赛维尔生物科技有限公司；平滑肌肌动蛋白α(α-SMA)、平滑肌22α(SM22α)一抗均购自武汉三鹰生物科技有限公司，荧光二抗购自泰安普美生物科技有限公司；含DAPI抗荧光淬灭封片剂购自上海翊圣生物科技有限公司，CCK-8试剂盒购自日本东仁化学科技有限公司。

1.2 血管平滑肌细胞分离及原代培养 选取叙利亚金黄地鼠2只，采用5%水合氯醛按0.65 mL/kg体质量腹腔注射麻醉。麻醉后将叙利亚金黄地鼠固定在固定器上，75%乙醇全身消毒，无菌条件下用手术剪纵向剖开外部皮肤至颈部，用弯镊钝性分离两侧皮肤，暴露腹部。换另一把无菌剪刀，剪开内部肌层，充分暴露内脏。剪开膈肌，小心暴露心脏，止血钳夹住剑突向上翻，充分暴露胸腔；翻开左肺，可见主动脉沿肺根部紧贴脊柱向下走行。用眼科弯镊夹住主动脉弓，眼科剪紧贴脊柱从主动脉弓部剪至腹主动脉。将主动脉放入盛有DMEM/F12培养基的培养皿中，漂洗血管内外的血凝块；将血管转移到第2个盛有DMEM/F12培养基的培养皿中，眼科弯镊小心剥去血管外膜和周围结缔组织；再将血管转移至另一干净培养皿中，小心纵向剖开血管，用眼科弯镊轻轻刮掉内膜；将血管剪成约1 mm3的小块，均匀铺展于25 cm2培养平底。翻转培养瓶，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度培养箱内，静置2 h。待组织块稍微干涸、紧贴培养瓶底部后，缓慢加入含10%胎牛血清、1%双抗(青霉素、链霉素)、89% DMEM/F12的完全培养基4 mL。轻轻翻转培养瓶，使培养基完全浸没培养瓶底部的组织块，继续置于细胞培养箱内进行培养。前3 d绝对静置培养，第3天换液，以后每隔2 d换液1次。

1.3 血管平滑肌细胞传代培养 待细胞融合80%时，进行传代培养。吸去培养基，PBS漂洗3次，加入0.25%胰蛋白酶1 mL，放入37 ℃培养箱中消化30 s。显微镜下观察细胞皱缩变圆、细胞间隙变大、轻拍培养瓶时大部分细胞从培养瓶底脱落时，加入含10%胎牛血清的完全培养基终止消化。用1 mL枪头轻轻吹打成细胞悬液，转移到15 mL无菌无酶离心管内，室温下以1 000 r/min离心5 min。弃掉上清，加入3 mL完全培养基重悬细胞，以1∶3的比例进行细胞传代，放入细胞培养箱继续进行细胞培养。

1.4 血管平滑肌细胞形态学观察 取原代培养3 d后的细胞及前3代传代细胞，200倍倒置相差显微镜下观察血管平滑肌细胞的大小、形态、排列规律以及生长特点。

1.5 血管平滑肌细胞鉴定 采用细胞免疫荧光技术。取第3代对数生长期的血管平滑肌细胞，以5×103/孔接种于铺有爬片的12孔板中。待细胞长至70%时，弃去孔板中的培养基，用预冷的PBS漂洗3次。4%多聚甲醛固定15 min(此操作完成后可-20 ℃保存)。PBS漂洗5 min×3次，0.3% Triton通透细胞，室温静置15 min。每孔加入10%山羊血清400 μL，室温封闭2 h，PBS漂洗5 min×3次。加入平滑肌细胞特异性标志因子α-SMA、SM22α一抗，4 ℃孵育过夜;0.3% Triton漂洗5 min×3次，PBS漂洗5 min×1次。加入二抗室温避光孵育1 h，0.3% Triton漂洗5 min×3次，PBS漂洗5 min×1次。用含DAPI的封片剂封片，200倍荧光倒置显微镜下拍照观察。

1.6 血管平滑肌细胞增殖能力观察 采用CCK-8法。取第3代消化好的血管平滑肌细胞悬液，以5×102/孔接种于96孔板，孔板最外围所有孔加入PBS 100 μL，防止蒸发影响外周细胞生长。每天相同时间点进行CCK-8检测，每100 μL培养基加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h。采用酶标仪检测490 nm波长处的光密度(OD)值，连续检测7 d。每组设置6个复孔，另设一组没有细胞只有培养基的空白对照组。

2 结果

2.1 原代与传代血管平滑肌细胞形态特征观察结果 原代培养3～5 d，有少量血管平滑肌细胞从组织中爬出，呈贴壁生长；原代培养7～9 d，细胞呈梭形或三角形，生长力旺盛，折光度好；原代培养9 d后，细胞增殖能力明显增强，细胞数量增多，细胞与细胞间排列紧密，出现“峰-谷”状特征；原代培养15 d左右可以进行传代培养。前3代传代细胞与原代细胞相比，形态无明显变化。

2.2 血管平滑肌细胞鉴定结果 荧光倒置显微镜下可见DAPI将细胞核染成蓝色，α-SMA、SM22α将细胞质染成绿色，血管平滑肌细胞纯度>95%；被α-SMA、SM22α绿染的细胞质中有大量平行于细胞长轴的肌丝。见图1。

注：A为α-SMA免疫荧光鉴定结果，B为SM22α免疫荧光鉴定结果。

2.3 血管平滑肌细胞增殖能力检测结果 血管平滑肌细胞培养1～7 d的OD值分别为0.437 3±0.021 5、0.460 0±0.018 8、0.614 3±0.022 5、0.845 3±0.027 4、0.862 5±0.024 0、0.828 0±0.027 1、0.816 0±0.020 2。见图2。

3 讨论

大鼠和小鼠由于成本低、易饲养，之前多被研究者作为动脉粥样硬化的首选动物模型。但是随着研究的深入，发现大鼠糖脂代谢机制与人类相差较大[5]，而小鼠存在一次性采血量少且不能连续采血的缺点[6]。叙利亚金黄地鼠属于啮齿类动物，体型介于大鼠和小鼠之间，在1930年从中东叙利亚引进[7]。研究表明，与大鼠、小鼠比较，叙利亚金黄地鼠血浆脂蛋白谱、肝脏合成胆固醇速率以及膳食胆固醇需要量和代谢率与人类更为相似[8～11]。因此，将叙利亚金黄地鼠作为高血脂、动脉粥样硬化、糖尿病等以糖脂代谢紊乱为特征的心血管病动物模型已成为一种趋势。为了深入研究上述心血管疾病的发病机制，体外培养稳定的叙利亚金黄地鼠血管平滑肌细胞模型也逐渐成为研究热点。

图2 叙利亚金黄地鼠第3代血管平滑肌细胞培养7 d的生长曲线(CCK-8法)

既往小鼠血管平滑肌细胞原代培养常采用酶消化法[12～14]，该方法价格昂贵且消化时间和配比浓度不好把控，有可能导致细胞获得量少、活性差等。因此，本研究选择组织块贴壁法[15]提取叙利亚金黄地鼠主动脉血管平滑肌细胞。在原代细胞的提取过程中，需将心血管外膜剥离干净，刮去内膜，以避免内皮细胞和成纤维细胞的污染，确保原代血管平滑肌细胞的纯度。本研究结果显示，分离提取的血管平滑肌细胞经过细胞形态学观察及细胞免疫荧光鉴定，血管平滑肌细胞纯度>95%；传代的血管平滑肌细胞培养1 d时处于增殖潜伏期，细胞增长缓慢；2～4 d处于对数生长期，增殖能力最强；5～7 d处于平台期，细胞出现生长抑制的现象，增殖能力开始降低。因此，本研究提取的血管平滑肌细胞传代后2～4 d是进行后续实验的最佳时期。

在细胞分离与培养过程中，为了提高血管平滑肌细胞的获得率和纯度，需注意以下几点：①选取健康的年轻叙利亚金黄地鼠(3～4周龄为宜)，年龄越小，原代细胞越容易从组织块中爬出，细胞活性和增殖能力也越好，即使在传代次数多的情况下，也能保证血管平滑肌细胞的稳定性。②为了防止污染，全程应注意无菌操作，所使用的器械均应高压灭菌后在超净工作台打开使用。③为提高血管平滑肌细胞的活性，在分离外膜时，应轻轻挤掉血管腔内的血凝块，不可过度牵拉血管；剪组织的剪刀要尽可能锋利，使组织块边缘平整，大小以1 mm×1 mm为宜；若组织块不平整或体积过大，会导致细胞爬出困难，原代培养失败；为避免细胞生长缓慢，组织块在培养瓶底部排列不可太过稀疏，也不可太过紧密，防止接触抑制现象的发生。④把组织块剪碎前要先将组织块稍微沥干，尽量减少组织块在无培养液环境中的暴露时间，有利于组织更好地贴壁。⑤注意把握培养瓶翻转的时间，当组织块紧贴培养瓶后再翻转，但若翻转时间过晚，会影响细胞爬出时间；翻转培养瓶时动作要轻，缓慢地将培养基没过组织块，避免组织块贴壁不牢而漂浮起来。⑥原代培养前3 d要绝对静置，不用换液。

综上所述，本研究成功采用组织块贴壁法分离培养出叙利亚金黄地鼠原代血管平滑肌细胞，并通过免疫荧光技术进行鉴定，为动脉粥样硬化等心血管相关疾病的基础研究提供可靠的细胞来源;细胞传代后2～4 d处于对数生长期,是进行后续实验的最佳时期。