心肌组织稳定过表达Hotair的新生小鼠模型建立及验证

费乔曼，邱曼曼，贾子恒，王雯雯，杨冰，张玲

天津医科大学基础医学院，天津300070

缺血性心脏病已成为全球第一大死亡原因，可引起心肌细胞大量缺失，其他类型的心血管疾病发展到最后也会伴随心肌细胞缺失；心肌细胞严重缺失可导致剩余心肌收缩力不足，从而引起心衰。长链非编码RNA(LncRNA)是指长度大于200个核苷酸、通常不编码蛋白质的RNA分子，以序列特异性方式与DNA或RNA的碱基配对，从而参与调控基因表达[1,2]。LncRNA对心脏的发育至关重要，并参与了心衰、心肌梗死和心肌肥厚等常见心血管疾病的发生发展，具有调节心肌重塑、心肌再生和改善心脏功能的特性[3,4]。Hotair被认为是一种心脏保护性LncRNA，其在心脏组织中过表达，可显著抑制缺氧诱导的心肌细胞凋亡[5]。也有研究表明，在心肌梗死[6]、糖尿病性心肌病[7]等多种心脏疾病的动物模型中，Hotair表达明显上调，但具体作用机制尚未阐明。2018年12月～2019年8月，本研究利用慢病毒载体原位感染的方法建立了心肌组织稳定过表达Hotair的新生小鼠模型，为进一步研究Hotair参与心脏疾病的相关机制提供可靠的动物模型。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物：6周龄清洁级ICR雌鼠4只、雄鼠2只，体质量约30 g，购自北京斯贝福生物技术有限公司，适应性饲养1周后按雌雄比2∶1进行交配。细胞：293T细胞由天津医科大学细胞生物学系实验室保存，DH5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。质粒：慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro购自北京安诺伦生物科技有限公司，慢病毒包装质粒包括pRSV-Rev(Addgene#12253)、pMDLg/pRRE(Addgene#12251)和pMD2.G(Addgene#12259)。主要试剂及仪器：DMEM高糖培养基购自美国Corning公司，转染试剂DNAfectinTMplus购自镇江爱必梦生物科技有限公司，PEG8000购自美国索莱宝公司，质粒小提试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司，兔多克隆抗组蛋白H3二甲基化的赖氨酸4(H3K4me2)抗体购自英国Abcam公司，兔多克隆抗组蛋白H3抗体购自美国Proteintech公司；实时定量荧光PCR仪购自美国ABI公司，电泳仪、转膜仪均购自美国Bio-Rad公司。

1.2 过表达Hotair的慢病毒质粒构建

1.2.1 目的基因Hotair获取 采用改良后的重叠延伸PCR法。按照DNA提取试剂盒说明书，提取正常P0期(出生24 h内)小鼠的心肌组织DNA，分别设计Hotair基因两段外显子序列的PCR引物。Hotair外显子1上游引物(F1)5′-AAAACTGTAATACTCAGACAGACAATTAAGC-3′，下游引物(R1)5′-TGAGCTTATAAGGAAGGAGTCGGTCC-3′；Hotair外显子2上游引物(F2)5′-TTCCTTATAAGCTCATCGGAGCACGATAG-3′，下游引物(R2)5′-AGATTCACAAACAAGAATTTATTTGCATTTG-3′。以提取的小鼠基因组DNA为模板，按照HiFi酶说明书进行PCR反应；分别以F1、R1为引物扩增Hotair基因的第一段外显子序列(452 bp)，以F2、R2为引物扩增Hotair基因的第二段外显子序列(1 777 bp);PCR产物经1 %琼脂糖凝胶电泳验证(图1A)，并用胶回收试剂盒纯化回收产物后备用。再以纯化回收后的两段外显子序列混合物为模板，以F1、R2为引物进行第二次重叠PCR，产物经过1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，获得Hotair基因序列全长(图1B)，并用胶回收试剂盒纯化回收。

注：A为Hotair基因两段外显子PCR产物；B为Hotair基因全长PCR产物。

1.2.2 慢病毒质粒构建 使用BamH Ⅰ单酶切载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro得到线性化载体，胶回收试剂盒纯化回收。按照诺唯赞一步克隆试剂盒说明书方案设计Hotair基因带有pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体同源臂的PCR引物，上游引物(F3)5′-ATTCGAATTTAAATCGGATCCAAAACTGTAATT-ACTCAGACAGACAATTAAGC-3′，下游引物(R3)5′-ATCCTTCGCGGCCGCGGATCCTGAGCTTATAAGGA-AGGCGTCGGTCC-3′，参照1.2.1，胶回收得到纯化的Hotair全长序列，依次为模板进行PCR反应，1%琼脂糖凝胶电泳分离，胶回收试剂盒纯化回收。按照试剂盒说明书进行后续重组转化，于37 ℃培养箱中过夜培养。第2天挑取多个单克隆菌落于5 mL具有氨苄抗性的液体LB培养基中，置于37 ℃、220 r/min摇床上过夜培养。质粒小提试剂盒提取质粒，送金唯智公司测序验证，将测序结果与Hotair序列(NR_047528.1)在Nocleotide BLAST软件上进行比对。结果显示构建的慢病毒质粒Hotair序列正确(图2)，证实目的基因Hotair准确插入到载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro中。

图2 Hotair基因慢病毒表达质粒的插入序列对比结果

1.2.3 慢病毒包装及浓缩纯化 采用高分子聚合物转染法。将四个慢病毒质粒共转染293T细胞，转染步骤按DNAfectinTMplus转染试剂说明书进行操作。分别于感染后48、72 h收集病毒液，0.45 μm滤膜过滤。配置5×PEG 8000-NaCl母液，包含NaCl 8.766 g、PEG 8000 50 g、超纯水200 mL；高压后4 ℃保存。每30 mL过滤后的病毒上清中，加入5×PEG 8000-NaCl母液7.5 mL；每隔30 min混匀1次液体，置于4 ℃冰箱；重复操作4次，置于4 ℃冰箱过夜。第2天，4 ℃条件下10 000 r/min离心30 min，弃上清；每管(初始病毒原液为30 mL)加入300 μL预冷PBS溶解病毒；将病毒分装后冻存于-80 ℃冰箱备用。

1.3 心肌组织过表达Hotair的新生小鼠模型建立及验证

1.3.1 动物分组及处理方法 取P0期小鼠18只(体质量约2.5 g)，采用随机数字表法分为Hotair过表达组、阴性对照组、空白对照组，每组6只。将各组小鼠置于冰上低温麻醉2 min，Hotair过表达组于左侧胸腔第五肋间隙注射浓缩后的Hotair慢病毒10 μL，阴性对照组和空白对照组分别注射等量空载病毒和生理盐水，待其复温后放回笼中饲养。各组注射4 d后处死小鼠，取心脏组织，用生理盐水灌注冲洗后液氮保存。

1.3.2 心肌组织Hotair、赖氨酸特异性去甲基化酶1(LSD1) mRNA表达检测 采用实时荧光定量PCR法。取出各组液氮冻存的小鼠心脏组织，按RNAiso plus说明书操作提取总RNA。以Random primer为引物，按照反转录试剂盒进行反转录。按照EVA Green Master Mix说明书进行PCR反应。PCR引物序列：Hotair上游引物5′-CAGAAGACACGCACGGAGAA-3′，下游引物5′-ATGACTGGTCCTCTTCCGGT-3′；LSD1上游引物5′-CGACTTCCCCATGACCGAAT-3′，下游引物5′-GAGTGGCTTCAAACGTCAGC-3′；β-actin上游引物5′-ACCTTCTACAATGAGCTTGCG-3′，下游引物5′-CTGGATGGCTACGTACATGG-3′。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火40 s，共40个循环。采用2-ΔΔCt法计算Hotair、LSD1 mRNA相对表达量。

1.3.3 心肌组织H3K4me2蛋白表达检测 采用Western blotting法。取出各组液氮冻存的小鼠心脏组织，剪碎后加入500 μL含有蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液，反复涡旋、冰浴后离心吸取上清液，按照BCA试剂盒说明书测定蛋白浓度。10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，湿转法将蛋白转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭；分别加入H3、H3K4me2一抗(稀释比例分别为1∶2 000、1∶1 000)，4 ℃孵育过夜；洗膜后加入二抗(山羊抗兔抗体，稀释比例1∶1 000)，室温孵育1 h；再次洗膜后加入ECL发光液进行曝光，利用Image J软件分析灰度值。以H3作为内参，计算H3K4me2蛋白相对表达量。

2 结果

Hotair过表达组心肌组织Hotair表达高于阴性对照组和空白对照组，H3K4me2蛋白表达低于阴性对照组和空白对照组(P均<0.01)。Hotair过表达组与阴性对照组心肌组织LSD1 mRNA相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1、图3。

表1 各组心肌组织Hotair、LSD1 mRNA及H3K4me2蛋白表达比较

图3 各组心肌组织H3K4me2蛋白表达情况(Western blotting法)

3 讨论

尽管现有的医疗手段不断在提升，能够有效控制心血管疾病的进展并改善患者预后，但人类心肌细胞的不可再生性是心血管系统疾病难以治愈的主要原因。长期以来，成年哺乳动物的心肌细胞一直被认为是无法再生的。2011年Porrello等[8]研究发现，新生小鼠的心脏组织受到损伤(心肌梗死或者部分心尖切除)后，可以刺激心肌细胞产生强大的再生潜能，这种再生能力在出生7 d后便丧失。近年来，新生小鼠心肌细胞的这种短暂的再生时间窗受到医学界广泛关注。研究表明，适当的炎症刺激和低氧环境有利于促进心肌细胞再生，且许多信号分子、转录因子和信号转导途径均参与调控哺乳动物心肌细胞的增殖[9,10]。Meis1是一种转录因子，参与介导心肌细胞周期停滞的调控[11]；Ponnusamy等[12]发现了一个新的LncRNA，并命名为CPR(被认为是一种心肌细胞增殖调节剂)，其研究结果表明CPR高表达与哺乳动物出生后及成年后心肌细胞增殖能力减弱密切相关。但目前为止，关于LncRNA参与调控心肌细胞增殖的信号通路研究甚少。

Hotair与多种癌症的发生和发展密切相关，现被认为是预测多种癌症患者预后、癌症复发、进展和转移预后的潜在指标[13]。在心血管系统中，Hotair过表达能够抑制炎症引起的心肌细胞凋亡[14,15]；在链脲佐菌素诱导的小鼠糖尿病性心肌病模型中，Hotair能够抑制心肌纤维化[7]；在脓毒症小鼠心肌细胞中，Hotair表达明显上调，Hotair被认为是心血管疾病进展的重要调节因子[16]。LncRNA与多种细胞功能有关，其中大多数功能需要与一种或多种RNA结合蛋白(RBP)相互作用，部分LncRNA可以通过组蛋白修饰在表观遗传学上调控基因表达。Hotair在心血管疾病中的相关研究大多是细胞水平的，众多作用机制尚未在动物中得到验证。因此，有必要建立一种便捷易操作的、在心脏组织过表达Hotair基因的动物模型，以便进一步研究Hotair对各器官及系统的影响。

本研究对传统的重叠延伸PCR技术进行改良，从小鼠基因组中获取Hotair基因。重叠延伸PCR技术是指在PCR技术的基础上，采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，通过重叠链的延伸，将不同来源的基因片段拼接起来的技术[17]。Cha-Aim等[18]研究表明，即使重叠序列短于15个核苷酸，该序列也可以产生可靠而且可重复的结果。Hotair第一段外显子的3′端和第二段外显子的5′端有7个核苷酸的同源序列，因此本研究利用其自身存在的同源臂，以两段外显子为模板，以第一段外显子的上游引物和第二段外显子的下游引物为本次扩增引物进行PCR，产物即为Hotair基因全长序列。相比传统的重叠延伸PCR技术，改良后的重叠延伸PCR技术可以更加便捷有效地扩增目的基因，实验结果可靠且操作可重复。

动物体内基因转染病毒载体有腺病毒、慢病毒和腺相关病毒。腺病毒因其包装滴度高、可插入片段大、瞬时表达能力强和在体内表达时间短等优点，广泛应用于动物基因转染实验中。腺相关病毒具有免疫原性极低、多血清型和相对组织亲和性高等特点，是比较理想的动物体内基因转染工具。但是腺病毒和腺相关病毒包装技术繁琐，时间较久，费用昂贵。此外，与腺病毒载体实现的瞬时表达不同，慢病毒具有有效的整合机制，可引起靶细胞中稳定的转基因表达[19,20]。相比前两种病毒，慢病毒是来自逆转录病毒科的单链RNA病毒，能感染分裂和非分裂细胞，因而作为基因递送载体被广泛应用。慢病毒包装简单易操作，浓缩和纯化过程也省时省力，经济成本低。本研究首次应用慢病毒载体介导的Hotair经胸腔注射转染新生小鼠心肌细胞，成功实现了Hotair在心肌组织的过表达，且该方法操作相对简便、经济，在病毒感染后第4天即可获得理想的动物模型。

Hotair公认的分子机制一方面是作为miRNA海绵来抑制miRNA的靶效应[12]，一方面则通过表观遗传学作用，Hotair的3′端结构域可以结合LSD1/CoREST/REST复合物，协调调节H3K4me2到H3K4me1的去甲基化[21]。LSD1是一种黄素依赖性单胺氧化酶，是组蛋白H3的特异性去甲基化酶，可通过脱去组蛋白H3单甲基化或二甲基化的赖氨酸4(K4me1/K4me2)或赖氨酸9(K9me1/K9me2)的甲基来调控靶基因表达[22]。本研究结果显示，小鼠心肌组织过表达Hotair后并不影响其LSD1 mRNA表达，但Hotair过表达会导致H3K4me2蛋白表达明显降低，说明Hotair过表达明显增强了LSD1的去甲基化功能。LSD1能够使结合在靶基因启动子区域的H3K4me2去甲基化，从而抑制或者激活靶基因的转录[23]。通过过表达Hotair能够增强LSD1对H3K4me2的去甲基活性，进一步验证本研究Hotair过表达动物模型构建成功，并且Hotair过表达后能够稳定发挥其功能。

综上所述，本研究成功应用慢病毒载体建立心肌组织稳定过表达Hotair的新生小鼠模型，该模型构建方法简便快捷，病毒感染后第4天即可检测到目的基因稳定表达，且Hotair过表达效果明显，能够显著增强LSD1对H3K4me2的去甲基活性，为后续研究Hotair参与心脏疾病的相关机制提供了可靠的动物模型。