元素指纹图谱用于安化黑茶的原产地判别

杨 纯，颜鸿飞，吕小园，陆 静，贺 鹏

（长沙海关技术中心，湖南 长沙 410004）

湖南安化黑茶因其具有上乘的特殊保健功效如降脂减肥、改善消化道、防癌抗癌等和深厚的文化底蕴而迅速发展和兴起，其独特的制作工艺已列入国家级非物质文化遗产。安化黑茶已获得中国驰名商标和地理标志产品保护的称号，深受消费者喜爱[1]。近几年市场上出现部分外路劣质茶（非正宗安化黑茶）加工成“安化黑茶”，大大影响了购茶者的消费信心，给湖南安化黑茶的声誉带来了严重影响。目前，安化黑茶的鉴别主要靠业内人士凭感官经验进行鉴别，没有系统有效的区分方法。现有保护安化黑茶的标准和公告等因其可以依据的理化成分指标较少且简单，难以将安化黑茶与其他产地黑茶区分开来。为了保护安化黑茶品牌，使地理标志产品、名优特产品的健康发展，需要使用科学的技术手段进行鉴别和区分检测，所以开发出一种湖南安化黑茶的产地溯源与鉴别方法成为必要[2-3]。

产地溯源旨在探寻表征不同地域来源产品的特异性指标[4-9]。茶叶品质与其产地的气候条件及加工方法有密切关系，不同产地茶叶中矿质元素含量存在一定的差异性[10-14]。近些年来，国际上应用矿物元素分析技术在产地溯源方面取得了较好的成果。Marcos[15]、Fernández-Cáceres[16]、Moreda-Piñeiro[17]等用电感耦合等离子体原子发射光谱、电感耦合等离子体质谱（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）对来自不同国家茶叶分别进行元素分析及产地溯源，可成功将中国茶叶与其他国家茶叶区分。近些年来，矿质元素指纹图谱分析技术在产地溯源方面取得了较好的成果[18-21]。现代仪器分析技术已经成为比较新型的茶叶分类、品质鉴定方法[22-23]。

本实验应用ICP-MS高通量光谱检测技术对湖南安化黑茶、云南普洱茶、广西六堡茶和湖北青砖茶共49 个茶叶样品中B、Li、P等48 种元素组分进行定量分析，得到黑茶元素指纹图谱，找寻有效区分识别湖南安化黑茶原产地特征元素指标，建立对湖南安化黑茶产地来源进行判别分析模型，以期为制定湖南安化黑茶可量化的原产地判别标准以及掺假识伪提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

选取不同产地的49 个黑茶样品进行研究，其中湖南安化黑茶22 个样品，购自湖南安化县茶厂；云南普洱茶样品13 个，广西六堡茶样品8 个，湖北青砖茶样品6 个，购自湖南茶叶市场，茶叶样品具体信息见表1。

硝酸（优级纯）；超纯水；茶叶标准物质（GBW10083） 国家标准物质研究中心；48 种元素的标准溶液（1 000 μg/mL） 中国计量科学研究院。

表1 茶叶样品Table 1 Geographical origins of tea samples tested in this study

1.2 仪器与设备

iCAP Q型ICP-MS仪 美国赛默飞公司；MARS6 Onetouch型高压微波消解器 美国CEM公司；ML204型分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司。

1.3 方法

1.3.1 标准曲线绘制

用5%稀硝酸溶液将48 种1 000 μg/mL的标准溶液逐级稀释配成以下质量浓度：P、Al、K、Ca、Fe、Mg、Na质量浓度为100、500、1 000、3 000、5 000 μg/L；Cu、Ti、Mn、Rh、Zn、Sr质量浓度为10、50、100、300、500 μg/L；B、Li、Be、As、Cd、Pb、Ga、V、Cr、Rb、Co、Ni、Se、Sn、Te、Mo、Cs、Sb、Ba、Tl、Tm、Yb、Ho、Er、Tb、Dy、Gd、Eu、Sm、Nd、La、Ce、Pr、Y、Lu质量浓度为1、5、10、30、50 μg/L。

1.3.2 内标溶液配制

用5% HNO3溶液将1 000 μg/mL的Sc、Ge、In、Bi、Re标准溶液逐级稀释为50 μg/L混合内标溶液。

1.3.3 元素含量测定

实验中所用的茶叶样品用食品搅拌机打碎，过60 目筛，贮存于塑料试样袋中。将样品于（103±2）℃（设定值103 ℃）烘干至质量恒定，用样品袋密封后放置于干燥器中保存待用。称取烘干茶叶样品约0.5 g（精确至0.000 1 g）置于四氟乙烯消化管内，加入5 mL硝酸，浸泡过夜，然后放入高压微波消解仪内进行消解，程序如表2所示。样品消解完全后取出，置于赶酸装置中于180 ℃赶酸，当消解液剩余约0.5 mL停止赶酸，冷却，将样品转移至25 mL容量瓶中，用水定容，摇匀，待测。随同制备样品空白溶液。将标准曲线、样品空白溶液、样品溶液依次导入ICP-MS进行元素含量测定，具体ICP-MS仪器参数见表3。

表2 微波消解程序Table 2 Optimal procedure of microwave digestion

表3 ICP-MS工作参数Table 3 Operating parameters of ICP-MS

1.4 数据处理

运用IBM SPSS Statistics 19和SIMCA P 11.5软件进行数据的变量筛选、主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘判别分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）等统计分析。

2 结果与分析

2.1 茶叶标准物质测定结果

按照本法对国家标准物质样品茶叶（GBW10083）中14 种元素进行6 次平行测定，结果见表4。表明本方法的测定值与茶叶标准物质样品标准值具有良好的一致性，样品前处理和仪器测定准确度均符合实验分析要求。

表4 茶叶标准物质测定结果Table 4 Certi fied and measured values of 14 elements in tea reference material

2.2 显著差异元素分析

表5 不同产地黑茶样品的48 个元素含量Table 5 Contents of 48 elements in Anhua dark tea from different geographical origgiinnss

不同产地黑茶中48 种元素含量测定结果见表5。黑茶中所有含的元素含量差异很大，K含量很高，均在15 000 mg/kg以上。P、Al、Ca、Mn、Mg含量在1 000～6 700 mg/kg之间，Te和Lu未检出，不同产地黑茶元素含量也各有其特征。云南和广西由于地理位置较近，所测元素含量都较接近，数据显示仅Rb、Co、Mo、Cs、Na、Tl、Ce在两地间的差异区分较为明显。4 个产地黑茶中湖北产地黑茶所测的元素含量大部分偏高，如Al、Pb、Ca、Ti、V、Cr、Mn、Fe等，原始数据显示每个省份平均含量差异显著的元素有Pb、Li、Ce、Ba、Gd、Ga等，对于组间类别区分较明显。进一步对48 种元素含量进行单因素方差分析，结果显示，在α=0.05水平上有显著差异的变量元素19 种，分别为Li、Pb、Ga、V、Cr、Fe、Rb、Mo、Cs、Sb、Ba、Na、Tl、Gd、Sm、Nd、La、Ce、Pr。

2.3 PCA结果

表6 主成分的方差贡献率Table 6 Eigenvalues and contribution rates to total variance of principal components

图1 黑茶样品的主成分得分投影图Fig. 1 PCA score plots of dark tea samples

主成分得分投影图能够直观地反映样本间的相似或差异性，能够进行各类样本的分布规律、品种分类、产地溯源和品质分级等研究[24,27]。本实验为得到黑茶样品的产地类别聚集趋势规律及特征，对49 个茶叶样品和19 种显著性差异元素含量的标准化数据进行PCA，得到前5 个主成分累计贡献率为88.441%，其中第1主成分贡献率为53.906%，前2 个主成分累计贡献率为68.964%，结果见表6。进一步运用SIMCA P 11.5进行PCA，得到以湖南安化黑茶和其他产地黑茶在PC1和PC2上的主成分得分投影图（图1）。由图1可知，安化黑茶和其他产地黑茶样品二维空间中的分布呈现出较好的类别聚集趋势。

2.4 PLS-DA结果

PLS-DA法可以消除相互重叠的数据信息，尤其是当自变量个数大于观察量个数时，其数据分析结果更加准确可靠[26]。为寻找更为有效的安化黑茶识别分析方法，本实验利用PLS-DA进行判别分析，通过每个样本点在PLS-DA得分图上的相对位置和分布情况显示样本的分类信息，从而达到样品识别的目的。本实验将49 个茶叶样本和19 个显著性差异元素含量的标准化数据作为变量，建立数据矩阵，根据茶叶产地信息的4 个类别即类别1（湖南安化黑茶）、类别2（云南普洱茶）、类别3（广西六堡茶）和类别4（湖北青砖茶），进行PLS-DA，所得PLS-DA图，见图2。湖南安化黑茶分布比较集中，云南普洱茶分布较为分散，广西和云南地域接近，茶叶特征（元素含量分布特征或指纹特征）较为接近，有部分交叉现象。但是湖南安化黑茶与其他产地黑茶类别聚集明显，都较为集中地分布在各自特征区域，能够很好地将湖南安化产地黑茶与其他产地茶进行识别。

图2 湖南安化黑茶与其他产地茶叶的PLSS--DDAAFig. 2 PLS-DA plot of Hunan Anhua dark tea and those from other regions

2.5 逐步判别分析

从茶叶样品中各元素指标的方差分析、PCA和PLS-DA结果可以看出，利用元素指纹图谱分析技术对湖南安化黑茶的原产地判别可行。为进一步了解各元素含量对黑茶产地的判别情况，对19 种特征元素含量的标准化数据按照统计量Wilk's λ最小值原则选择变量，进行逐步判别分析，建立判别方程。结果显示Li、Pb、Ga、Ce、Rb、Cs和Na 7 种元素先后被引入判别模型中，所建立的判别模型如下：

类别1（湖南安化黑茶）=－5.274－0.406（Li）－5.371（Pb）+6.173（Ga）－1.480（Ce）－5.052（Rb）－4.513（Cs）－1.201（Na）

类别2（云南普洱茶）=－10.139－10.639（Li）+2.742（Pb）－5.568（Ga）+0.050（Ce）+3.463（Rb）+0.288（Cs）+3.846（Na）

类别3（广西六堡茶）=－33.465+0.228（Li）+6.700（Pb）－12.156（Ga）－3.591（Ce）+17.773（Rb）+11.232（Cs）+2.167（Na）

类别4（湖北青砖茶）=－16.329－4.953（Li）+10.681（Pb）－6.363（Ga）+12.182（Ce）－4.213（Rb）－1.005（Cs）－0.239（Na）

利用此模型对样品进行归类，进行回代检验和交叉验证分析（表7），回代检验判别率为100%，交叉验证判别率为98%，说明Li、Pb、Ga、Ce、Rb、Cs和Na这7 种元素指标对黑茶产地判别效果好。熟度较高，且矿物质集中的成熟叶、茎、梗一同作为原料发酵，矿质元素含量比其他茶类较高。黑茶原料黑毛茶采摘的时节、级别、树种等对茶叶的元素含量也存在影响。再次，可能与安化黑茶独特的加工工艺有关。安化黑茶最具特征的工序是在初制进程中的“渥堆”发酵工序与“松柴明火”干燥工序及在精制过程中“渥堆”等过程，都对茶叶元素含量都存在一定的影响。总之，茶叶元素含量指纹特征是土壤环境、工艺、原料、茶树等多种因素的综合影响结果。因此，需要进一步研究分析安化黑茶的产地土壤环境、原料品种、加工工艺、茶树种类等对黑茶元素含量的影响，才能更加系统阐述和探究安化黑茶矿物质元素指纹特征的形成原因，为安化黑茶的产地溯源分析提供理论基础和技术参考。

表7 黑茶产地判别分析Table 7 Classi fication with discriminate analysis of dark tea samples

4 结 论

3 讨 论

本研究采用ICP-MS法得到湖南安化黑茶的元素含量指纹图谱信息，能够较好地表征安化黑茶原产地特征。不同产地黑茶样品微量元素种类基本相同，但一些元素含量差异显著。各产地黑茶有着各自的特征元素，相邻地区样品元素含量和特征元素相近，如湖南与湖北黑茶元素含量较为接近，云南与广西黑茶元素含量相近。安化黑茶中微量元素种类较丰富，其中含量较高最具代表的矿物元素为P、Cu、Al、K、Cr、Ca、Mn、Fe、Zn、Ba、Na、Mg，其中Zn、Mn、Cu为超氧化物歧化酶的构成元素，具抗氧化作用，含量分别高达35.529、1 471.8、19.039 mg/kg，对人体健康大有益处；稀土元素的含量较低，如Cs、Gd、Sm、Nd、La、Ce、Pr等，过量的稀土元素会影响茶叶的品质危害人体健康[28-29]。与其他产地黑茶存在明显差异的特征元素为稀土元素（以Ce为突出代表，以及Cs、Gd、Sm、Nd、La、Pr等），以及被引入判别模型的碱金属元素Li、Na、Rb、Cs。安化黑茶以上显著性元素特征可能与安化县茶叶生长土壤相关。安化县内土壤以板页岩风化发育的土地面积最广，茶园土质较好，土壤以酸性和弱性为主，酸碱度适宜，养分含量较高[30]。这些特征元素能够较好地表征安化黑茶原产地特征，可以作为鉴别安化黑茶产地的重要技术指标。

“安化黑茶”作为地理标志保护产品，主要指产自于湖南省安化县内特定生长区域，采用安化雪峰山脉茶区的大叶种群体品种为原料，经过四大复杂的工艺加工而成，具有明显的地域性[30]。首先植物中矿物元素含量特征与其产地环境中矿质元素的含量密切相关。安化黑茶元素含量与安化地域独特的地理位置和土质有关，氮、钾和硒等有机质含量丰富。其次，可能与安化黑茶的加工原料黑毛茶有关。安化黑茶采制原料黑毛茶的成

本实验采用ICP-MS对安化黑茶及其他产地黑茶中的B、Li、P等48 种元素组分进行定量分析，得到黑茶元素指纹图谱。利用方差分析得到具有显著性差异的元素有Li、Pb、Ga等19 种，云南和广西由于地理位置较近，所测元素含量都较接近，4 个产地黑茶中湖北产地黑茶所测的元素含量大部分偏高；利用PCA和PLS-DA对湖南安化黑茶与其他产地黑茶类别进行判别分析，得到主成分得分投影图和PLS-DA图，各个产地的黑茶样品在各自特征区域聚集较明显，能对湖南安化黑茶与其他原产地黑茶进行有效区分和识别；采用逐步分析得到4 个产地判别模型，其中被引入产地判别模型的元素有7 种，依次为Li、Pb、Ga、Ce、Rb、Cs和Na，所建立的判别模型对样品回代检验判别率为100%，交叉验证判别率为98%。结果表明基于元素指纹图谱结合化学计量学统计方法对湖南安化黑茶的原产地判别可行。