梅尼埃病患者外周单核细胞的基因表达谱分析及药物发现

黄巧 翟思佳 廖行伟 刘宇超 尹时华

广西医科大学第二附属医院耳鼻咽喉头颈外科(南宁530007)

MD是以反复发作性眩晕、波动性听力下降为临床特征，伴有耳鸣和耳胀满感的内耳疾病。它的基本病理表现为内淋巴积水，与内淋巴分泌和重吸收失衡有关。随着生物信息学发展，越来越多学者研究疾病与多个基因间的联系。MD的基因学研究也逐渐深入，孙莹基于RNA-seq技术研究表明，免疫因素可能影响梅尼埃病的发病过程[1]。本研究检索GEO数据库中MD患者相关基因表达谱，鉴定差异基因及分析差异基因的功能及信号通路，探索MD的发病机制，并通过cMAP数据库筛选潜在治疗MD的小分子化合物，为深入研究MD的治疗方案提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

以“Meniere's disease”为检索词，在美国国立生物技术信息中心(NCBI)的GEO数据库进行搜索，获得GSE109558数据集。

1.2 方法

利用GEO数据库在线分析工具GEO2R，根据差异基因的条件：P＜0.05，|LogFC|≥1.5筛选差异表达基因。将差异表达基因上传至DAVID6.8数据库，进行在线分析基因本体(Gene Ontology,GO)功能注释和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）通路分析。通过STRING数据库获得PPI数据，并利用Cytoscape3.7软件进行网络互作图构建及可视化分析。最后应用cMAP数据库根据P＜0.05且|富集分数|＞0.9筛选可能为治疗MD的潜在小分子药物。

2 结果

2.1 差异表达基因

根据差异基因的条件，获得差异基因53个，其中上调基因22个，下调基因31个。

2.2 富集分析

对差异表达基因富集分析，结果显示GO分析富集在防御对病毒的反应、对病毒的反应、成肌细胞融合的负调节、蛋白水解、防御反应、细胞外基质拆解、骨吸收的积极调节、骨骼肌组织再生、趋化、丝氨酸型肽酶活性、丝氨酸型内肽酶活性、MHC II类蛋白结合、MHC II类蛋白质复合物结合等生物过程，细胞定位在胞外（如表1）。KEGG显著富集在Influenza A（如图1）和Herpes simplex infection两个途径（如图2）。

表1 GO分析Table 1 GO analysis

图1 Influenza A信号传导通路示意图（标注五星的位置为本研究中蛋白）Fig.1 Schematic map of the Influenza A(the location of the five stars is the protein in this study)

图2 Herpes simplex infection信号传导通路示意图（标注五星的位置为本研究中蛋白）Fig.2 Schematic map of the Herpes simplex infection(the location of the five stars is the protein in this study)

2.3 PPI分析

从STRING数据库获取得分≥0.4的PPI数据，利用Cytoscape3.7可视化分析显示，该网络由21个节点和35个边缘组成（如图3）。用插件CentiScaPe计算节点度，根据节点度≥5获得8个关键基因，分别为CXCL10（CXC 趋化因子配体 10）、IFI44L、POTEE（POTE锚蛋白结构域家族成员E）、IFI44（干扰素诱导蛋白44）、XAF1（X染色体连锁凋亡抑制蛋白相关因子1）、OAS2（2′,5′-寡聚腺苷酸合成酶）、HERC5（HECT类E3连接酶5）、EIF2AK2（蛋白激酶PKR）（如表2）。

图3 PPI网络分析（红色节点代表上调差异基因，绿色节点代表下调差异基因；节点大小与节点度正相关，节点度越大节点的形状越大。）Fig.3 The PPI network analysis(Red nodes correspond to upregulated genes and green nodes correspond to down-regulated genes.Node size is positively correlated with node degree,the higher the degree value,the bigger the node size is.)

表2 8个关键基因Table 2 The eight key genes

2.4 药物筛选

将53个差异表达基因映射到cMAP数据库，总共获得33个相关小分子药物，根据enrichment筛选出前10个负性相关且P＜0.05的小分子药物（如表3）。经查阅文献，这十个小分子药物的机理作用见表4。

3 讨论

MD是常见的内耳疾病，其病因复杂至今尚未明确。随着科学技术的发展，MD的基因学及免疫学研究备受关注，许多基因被证实与MD有关，如人类组织相容性白细胞抗原(HLA)[2]。有研究发现，部分MD患者的促炎细胞因子水平升高，并且可能具有自身炎症性内耳疾病，某些过敏原可能诱发内淋巴积水[3]。内淋巴囊具有免疫调节功能，梅尼埃病的机制可能与免疫反应引起的内淋巴分泌和重吸收失衡有关，且临床上免疫抑制剂治疗梅尼埃病具有良好效果，因此，免疫因素可能是梅尼埃病的病因之一[4]。本研究通过生物信息学方法从MD患者外周单核细胞筛选出的8个核心基因多与免疫学相关，其中CXCL10、IFI44L、IFI44、XAF1、OAS2、HERC5、EIF2AK2为上调基因，POTEE为下调基因。

表3 cMAP数据库筛选出的前10个小分子药物Table 3 Top ten small molecule drugs screened from cMAP database

CXCL10为CXC家族趋化因子，是免疫学标志物。研究表明CXCL10在系统性红斑狼疮、类风湿血清中表达升高，且可能提示与疾病活动有关[5,6]。IFI44L与IFI44为干扰素（IFN）I型诱导基因，参与IFN诱导的多种生物学功能，通过抑制病毒复制，激活自然杀伤细胞，促进树突状细胞的产生和活化以及增强抗体反应，在先天免疫中起重要作用[7]。XAF1为凋亡抑制蛋白（XIAP）的拮抗蛋白，它的表达水平与凋亡呈正相关，通过激活凋亡通路途径促进癌细胞凋亡，有望成为治疗癌症的理想基因靶标。12号染色体上的寡聚腺苷酸合成酶（OAS）基因包含有3个基因（OAS1，OAS2，OAS3），编码2'-5'OAS酶，在对病毒的先天免疫反应中起关键作用[8]。ISG15是一种非常快速诱导的IFN刺激基因，HERC5是ISG15的主要E3酶，已被证明具有抗甲型流感病毒的抗病毒活性，其能通过泛素化反应清除细胞局部无效蛋白分子，促进IFN效应基因的表达[9]。EIF2AK2也称蛋白激酶PKR，其广泛调节炎性体激活，如Nod样受体蛋白3(NLRP3)炎症体，PKR失活将严重损害炎症小体激活，因此可能通过该分子药理学靶向治疗炎症[10]。本研究筛选出的上调核心基因多在系统性红斑狼疮、类风湿中表达水平升高，且提示与疾病活动有关，有研究发现，MD患者中系统性红斑狼疮的发病率升高，这提示MD可能与自身免疫性疾病相关。POTE被称为癌抗原，在许多癌症中表达，以及极少数正常组织如前列腺，卵巢和睾丸。到目前为止，POTEE确定为主要表达的POTE旁系同源物。Vekariya等[11]首次报告POTEE在免疫细胞中的表达，特别是在巨噬细胞中特异性表达，而不是在单核细胞或T细胞，且参与细胞存活，此外，在肿瘤相关巨噬细胞中发现升高的POTEE还通过活化mTORC2表现出增强的细胞侵袭性。因此，本研究筛选出的8个核心基因可能通过免疫反应在MD发病机制中起重要作用，但仍需进一步实验验证。

通过对差异基因GO分析发现，这些基因富集在防御对病毒的反应、对病毒的反应、成肌细胞融合的负调节、蛋白水解、防御反应、趋化、丝氨酸型内肽酶活性、MHC II类蛋白结合、MHC II类蛋白质复合物结合等生物过程，细胞定位在胞外。KEGG信号通路分析发现这些差异基因主要Influenza A和Herpes simplex infection两个途径。与前期研究结果一致，众多细胞生物学过程、信号通路都与免疫系统密切相关[1]，提示MD可能具有自身炎症性内耳疾病。

此外，本研究通过cMAP筛选出前十个关联度最大的负性相关小分子药物。赖诺普利为血管紧张素转换酶抑制剂，间接通过肾素-血管紧张素-醛固酮系统靶向盐皮质激素受体（MR）。MR与GR在内耳中均有表达。糖皮质激素广泛用于治疗内耳疾病，其不仅通过GR介导，还通过MR介导[12]。因此，赖诺普利有可能通过靶向MR调节钠、钾和其他离子的平衡达到治疗MD的目的，目前尚未有研究该药物用于治疗内耳疾病。异卡波肼单胺氧化酶A/B型抑制剂，用于抗抑郁。MD患者常受眩晕、耳鸣困扰，给患者造成极大的心理负担，抗抑郁药可作为其辅助治疗。柚皮素为免疫调剂，不仅能提高抗肿瘤免疫反应，还能缓解自身免疫疾病的过度活化状态[13]。伏立诺他为组蛋白去乙酰化酶抑制剂，临床上已被用作抗癌药物，并具有免疫抑制特性。使用免疫疗法的MD患者眩晕发作的持续时间和频率有所改善[3]，因此，使用免疫疗法作为控制眩晕发作的治疗计划的一部分应该被考虑到，柚皮素与伏立诺他将有可能用于MD的免疫治疗。哌仑西平为选择性抗胆碱能药，乙酰胆碱是橄榄耳蜗传出系统的主要神经递质，为耳蜗毛细胞和感觉神经元提供反馈，毒蕈碱受体拮抗剂可增强内耳对噪声诱导的听力损失的抵抗力。饶秀丽等[14]通过制造反复眩晕模型发现毒蕈碱受体M2、M3亚型在前庭内侧核表达增加，而MD是否也存在毒蕈碱受体表达增加，抗胆碱药是否能通过降低毒蕈碱受体表达改善MD病症状？炔诺酮有较强的孕激素作用，可以对抗雌激素，并增加雌激素的代谢。绝经前后女性体内的性激素分泌减少，导致出现植物神经功能紊乱等问题，在某种程度上影响着女性MD的发生与发展。激素替代疗法可能在一定程度上可以减缓女性MD的临床症状。阿司匹林为抗血小板凝集剂，临床病例分析发现阿司匹林作为联合用药用于短暂性脑缺血发作性眩晕[15,16]和偏头痛性眩晕[17,18]的治疗，可减少眩晕发作程度及频率，改善患者生活质量。昂丹司琼5-HT3受体拮抗剂，临床上用于止吐，可用于MD发作时出现的恶心呕吐。上述筛选的小分子药物，如赖诺普利、柚皮素、伏立诺他等有可能成为MD的治疗或者辅助药物。

表4 选出的前十个小分子药物的机理作用Table 4 The mechanism of top ten small molecule drugs

总之，本研究通过生物信息学方法得出MD可能与自身免疫性疾病相关，使用抗组胺药或免疫疗法应该作为控制眩晕发作治疗计划的一部分，筛选出的基因可能成为梅尼埃病潜在生物标记物，筛选的小分子药物有可能成为MD的治疗或者辅助药物，为MD的病因学研究及治疗提供依据，但仍需进一步深入研究。