不同活性干酵母对椴树蜜酒发酵的影响

薛 松，刘彩云，于 帆，林 剑

（1.烟台大学生命科学学院，山东烟台 264000；2.烟台华海生物制品有限公司，山东烟台 264000）

蜂蜜中含有糖类、蛋白质、矿物质及多酚类化合物等，所含物质总数超出200 多种[1]，并且具有抑菌消炎、抗衰老、增强免疫力等多种生物活性功能，被认为是自然界中的天然保健品[2]。椴树蜜拥有椴树花浓郁清新的香味[3]，清新香甜，是东北特有的蜜种之一，其营养成分的含量高于普通蜂蜜。椴树蜜中的高营养成分决定了其是一种天然的滋补品，但是由于其富含高含量的糖类物质而使其饮用人群大大受限[4]，因此，将其制成一种适合多数人饮用的发酵饮料具有重要的应用价值。

蜜酒具有十分悠久的历史，曾经被称之为世界上最古老的酒精饮料，其出现的时间比之葡萄酒和啤酒都早约几千年[5]。椴树蜜酒是以椴树蜜为原料，经过发酵、过滤、陈酿后制成，研究表明，经发酵酿制而成的蜜酒，除了蜂蜜本身所含的绝大部分葡萄糖和果糖转化为乙醇外，蜂蜜原有的氨基酸、维生素、矿物质、多酚类化合物和超氧岐化酶等成分得到保留[6]，因此，椴树蜜酒既包含椴树蜜原本的营养成分，又有发酵酒的醇香，是一种口感柔和的低度保健饮料酒[7]。

传统的蜜酒酿造过程存在较多的问题，例如：发酵时间的延迟、发酵过程中不良风味的产生进而导致蜜酒产品的感官品质降低。因此，以科学的手段提高蜜酒的品质是目前研究的关键所在[8]。酵母菌是蜜酒酿造过程中最为关键的所在，不同酵母在发酵过程中，由于代谢产物种类和含量的差异，发酵所得产品的质量和类型也有所不同[9]，因此研究人员在酿制蜜酒的过程中通常会对酵母进行选择，如史莹[10]从乌桕蜂蜜中筛选出1 株酿酒酵母，相比较对照组的酵母更耐酒精，而且发酵所得的蜜酒口感更出色。因此，优选出最适的椴树蜜酒酵母是椴树蜜酒发酵产业的关键问题。

长期以来，国内外的科研人员大多采用单一的方法对发酵酒进行评价，冯红艳等[11]采用气相色谱法测定啤酒中的风味物质，为啤酒生产确定最佳工艺参数；黄琳等[12]单一以感官评分为评价指标，研究了不同发酵条件对啤酒感官品质的影响。以单一因素对蜜酒产品进行评判，因多方面的原因会导致实验结果不够准确，进而误导对产品的最终评判。本研究以椴树蜜酒感官得分同时联合气相色谱技术，通过模糊综合评判法对蜜酒进行综合评价，进而优选酵母，为椴树蜜酒发酵过程中活性干酵母的优选提供更加准确、科学、可信的评判结果。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器

1.1.1 酵母菌株

选用葡萄酒酿造过程中广泛使用的活性干酵母，分别编号为F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7、F8，由烟台帝伯仕自酿机有限公司提供。

1.1.2 椴树蜜

中蜂国际生物科技有限公司提供。

1.1.3 仪器设备

高效液相色谱仪（Waters 1525），美国Waters 公司；气相色谱仪（Agilent 7890A），美国Agilent公司。

1.2 实验方法

1.2.1 椴树蜜酒精发酵工艺流程

椴树蜜→调整可酵解糖浓度和pH 值→灭菌→接种→发酵→过滤、除菌→椴树蜜酒样

操作条件：调整培养基中可酵糖含量为160 g/L，添加2 ‰的酵母浸出物作为外加氮源，磷酸调整pH5.5，120 ℃灭菌20 min，冷却后待用。将活性干酵母在25 ℃条件下静置复水活化30 min[13]，按照2 %的接种量接种到培养基中。25 ℃条件下进行发酵[14]，每隔24 h取样1次，对样品离心、抽滤，采用高效液相色谱法测定样品中的还原糖和酒精含量。

1.2.2 分析方法

1.2.2.1 发酵液中还原糖的测定——高效液相色谱法

色谱条件[15]：流动相0.01 mol/L H2SO4，流速0.5 mL/min，进样量20 μL，柱温50 ℃。

1.2.2.2 发酵液中酒精的测定——高效液相色谱法

色谱条件：流动相0.01 mol/L H2SO4，流速0.5 mL/min，进样量20 μL，柱温50 ℃，示差折光检测器温度50 ℃。

1.2.2.3 发酵液中挥发性风味物质的测定——气相色谱法

色谱条件[16]：检测器温度280 ℃，进样温度100 ℃，进样时间1 min，样品瓶压力1.39×105 Pa，载气为N2（99.999 %），流速为4 mL/min，H2流速30 mL/min，空气流速400 mL/min。

1.3 椴树蜜发酵所得酒样的感官评价

感官评价组由2 名发酵专业老师及12 名相关专业学生组成，按照表1 评分标准对8 株不同活性干酵母发酵所得酒样进行评分。

1.4 活性酿酒干酵母的优选

通过比较8 株不同活性酿酒干酵母的发酵性能，综合椴树蜜酒精样品的感官得分及其所含挥发性风味物质的含量，利用模糊综合评判法优选出最佳椴树蜜酒酿造活性干酵母。

2 结果与讨论

2.1 不同酵母发酵性能的比较

参照方法1.2.2.1 和1.2.2.2，对8 种不同菌株发酵能力的测定结果见图1、图2。

由图1 和图2 可以看出，F1 和F5 菌株无论是在底物还原糖的消耗还是产物乙醇的生成速度方面都是较慢的，说明其发酵能力相对较弱；F4 菌株较剩下其余菌株的发酵能力较强；菌株在前6 天发酵速度相对较快，在第6 天以后，由于底物浓度的减小以及产物浓度的增大，产生阻遏作用，菌株的发酵速度减慢，相对平缓，在第9天时，发酵结束。

表1 感官评分细则表

2.2 不同菌株发酵椴树蜜酒中香气成分含量的测定及感官评分

参照方法1.2.2.3和1.3，对8株不同酵母菌株发酵所得蜂蜜酒中香气成分含量的感官得分及测定结果见表2和表3。

表2 不同椴树蜜酒样的感官得分

高级醇和酯类是酵母正常发酵的代谢产物，也是组成酒类风味的重要成分[17]，是酒类香气的主要载体，赋予酒类醇厚感。实验共选取7 种对蜂蜜酒风味影响较大的物质进行分析，结合表2 感官评分发现，感官评分得分较高的酵母菌株，相对应蜂蜜酒香气成分中高级醇和酯类物质的含量也略高于其他菌株。

表3 不同椴树蜜酒样中主要香气成分的定量分析结果

2.3 模糊综合评判法优选最佳活性干酵母

2.3.1 建立评判对象集

2.3.2 建立评判因素集

根据已有文献报道[18]，确定高级醇和酯类为椴树蜜酒中的主要挥发性成分，同时结合表2 的感官评分，建立评判因素集为X={x1，x2……，xn}={x1，x2，x3}，其中x1—感官评分，x2—高级醇类，x3—酯类。

2.3.3 建立隶属函数模型

根据表2 构造感官评分因素的隶属函数（感官评分低于70分的样品不参与评价）：

U（x1）=x1/100，70≤x1＜100

椴树蜜酒香气成分的含量在一定范围内与椴树蜜酒的品质呈正相关，所以可以构造高级醇和酯类的线性上升隶属函数[19]，结合表3 构造隶属函数如下：

2.3.4 建立权重集

研究表明，高级醇和酯类对酒类产品的香气影响较大，且酯类的影响更加明显，结合感官评价，根据德尔菲法（Delphi technique）[20]确定权重分配为A={a1，a2……，an}={a1，a2，a3}={0.35，0.3，0.35}，其中

2.3.5 模糊综合评判计算

对Ui的每个因子利用U（xi）进行模糊化，可得到x×y上的模糊矩阵R：

利用模糊线性变换法得到的评判结果为：

B=A × R=[0.623 0.649 0.727 0.794 0.559 0.899 0.613 0.841]，

其中，模糊算子为M（·，⊕），即，（j=1，2，k，n），归一化处理得：

B=[0.109 0.113 0.127 0.139 0.097 0.157 0.107 0.147]

模糊综合评判的结果椴树蜂蜜酒品质方面体现出不同酿酒酵母的优劣，结合上述8 株不同活性干酵母发酵性能测试结果可以得出各酵母菌株的优劣：F6＞F8＞F4＞F3＞F2＞F1＞F7＞F5。可以看出F6 酵母为最佳椴树蜜酒发酵酵母，F8 和F4 次之，F5酵母菌株发酵性能最差。

3 结论

本研究测定了发酵过程中8 株不同酿酒活性干酵母菌株对底物的消耗速率及产物的生成速率，以所得不同酵母菌株的发酵性能作为参照，结合不同酵母菌株发酵所得椴树蜜酒样感官评价得分以及其所含挥发性风味物质含量的测定，利用模糊综合评判的方法优选出F6 酵母为最佳椴树蜜酒酿酒活性干酵母，后续仍需对优选出的酵母菌株做深入的发酵过程动态研究。本方法对于其他酒类饮品所用最佳酿酒酵母的优选也具有一定的参考意义，为酵母的优选提供了一种更科学、可信的途径。