液相色谱质谱联用法测定鸡肉中恩诺沙星含量的不确定度评价

史 梅

新疆维吾尔自治区兽药饲料监察所，乌鲁木齐830000

恩诺沙星（enrofloxaein，ENR）是一种氟喹诺酮类药物，是家禽养殖中广泛使用的抗生素，具有抗菌谱广、杀菌活性强等优点，被广泛使用，对预防和治疗动物细菌性疾病和支原体感染方面具有较高疗效[1-2]。然而部分企业和养殖户为追求畜禽快速增长及预防其生病而忽略安全添加剂量，无视休药期等规范用药而造成抗生素滥用。忽视用药规律而长期滥用抗生素会导致耐药性[3-6]，最终影响畜禽产业发展和人类的健康。因此，在畜禽产品中检测氟喹诺酮类药物含量非常有必要。在检测分析中，由于受检测仪器、检测方法及试验误差的影响，检测值往往低于真实值。如何判定检测结果真实有效，不确定度是一个重要的参考指标。不确定度可反映测量结果的准确性和可靠性[7]，其受诸多因素的影响。然而，1 个试验的不确定度评价往往较为困难，需要考虑诸多因素和试验环节。本文通过参照中国农科院建立的评价《鸡蛋和鸡肉中氟喹诺酮类药物及金刚烷胺残留测定操作细则》中恩诺沙星的不确定度的方法，及其他相关技术文献和指南[8-9]，评定液相色谱质谱联用法（LCMS）测定鸡肉中恩诺沙星含量的不确定度，以期为氟喹诺酮类药物检测方法的改进提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

液相色谱质谱联用仪：Waters Xevo TQ-S，美国沃特世公司，METTLER TOLEDO MS105DU 万分之一电子分析天平，METTLER TOLEDO 公司生产；Eppendorf 移液器（20、100、1 000 μL），德国Eppendorf 公司；C18 固相萃取柱（100 mg/3 mL），安捷伦公司生产。恩诺沙星标准品（批号50128，德国Dr 公司，纯度98.5%），内标为恩诺沙星D5 标准品，乙腈、正己烷、乙酸、甲酸均为色谱纯，氢氧化钠为分析纯，水为一级水。

1.2 方 法

1）恩诺沙星测量方法。

①标准品和内标工作液的配置。精密称取恩诺沙星标准品10 mg，用甲醇定容至10 mL 棕色容量瓶中，制得质量浓度为1 mg/mL 的标准储备液，-20 ℃冰箱保存，同位素内标配制按如上操作。用移液器将标准品和内标储备液逐级稀释，最终用流动相定容上机工作液恩诺沙星和内标均为20 ng/mL。

②样品前处理。取2.00 g 鸡肉样品于50 mL离心管中，加入10 mL 1%乙酸乙腈，涡旋提取2 min，10 000 /min 离心5 min，上清转入另一离心管中，重复提取1 次，合并上清液，50 ℃氮吹至干，加磷酸盐2 mL 溶解残渣，C18 固相萃取柱净化，先用2 mL 乙腈和2 mL 磷酸盐缓冲液活化平衡，将待净化液过柱，用2 mL 水淋洗，真空抽干，用1 mL 0.1%甲酸乙腈水溶液洗脱，真空抽干，洗脱液过0.22 μm 滤膜后上机测定。

③色谱条件。

A.色谱柱：BEH C18 1.7 μm ×2.10 mm×50 mm。

B.流速：0.3 mL/min。

C.进样体积：2 μL。

D.流动相：0.1%甲酸乙腈溶液。

④质谱条件。

A.离子源：电喷雾离子源（ESI+）。

B.扫描方式：多反映离子监测（MRM）。

C.离子源温度：600 ℃。

D.离子源喷雾电压：5 500 V。

⑤结果计算。

恩诺沙星用恩诺沙星-D5 校准，单点校准，按如下公式计算恩诺沙星含量：

式中：A——待测样品中恩诺沙星的面积；

A’is——标准品中恩诺沙星内标的面积；

As——标准品中恩诺沙星的面积；

Ais——待测样品中恩诺沙星内标的面积；

Cs——标准品中恩诺沙星的质量浓度（ng/mL）；

Cis——样品中恩诺沙星内标的质量浓度（ng/mL）；

C’is——标准品中恩诺沙星内标的质量浓度（ng/mL）；

V——溶解残余物所用试样溶液体积；

m——供试试样的质量（g）。

2）测量不确定度分析。在本试验的不确定度分析中，首先考虑多次测量引入的不确定度，其次考虑每一步试验操作中可能影响结果的步骤操作产生的不确定度，即样品称量、标准品配制、定容体积、恩诺沙星标准溶液峰面积和恩诺沙星内标峰面积这些因素引入的测量结果的不确定[10]。

①测量重复性的不确定度的确定。为了得到一个可靠性较高的测量重复性标准偏差，在本次试验测量中，平行测量6 个试验样品，测量值见表1。

6 个样品恩诺沙星含量的平均值为9.88 μg/kg，按贝塞尔公式计算测量重复性标准。

相对标准偏差RSD 为：

在以6 个样品的平均值报告测量结果时，相对标准不确定度按如下公式计算：

此分量已经合并了试样不均匀、环境条件的波动以及操作的差异等随机因素的影响。因此，在随后进行的不确定度分量评定时就不需要再考虑这些随机因素的影响。

②试样质量的不确定度的确定。天平校准证书说明校准的扩展不确定度为0.05 mg，包含因子k=2，因此其标准不确定度为0.025 mg。试样质量为2 g，其相对标准不确定度应为urel（m）=1.25×10-5。

③定容体积的不确定度的确定。检定规程JJG196-1990《常用玻璃量器》规定，10 mL A 级容量瓶的允许误差为0.02 mL，假设为三角形分布，其相对不确定度应为：

④恩诺沙星标准溶液的不确定度的确定。恩诺沙星标准品纯度为98.5%±1.5%，由于没有不确定度的其他信息，假设是均匀分布，标准不确定度u（P）的值为：

⑤恩诺沙星标准溶液峰面积和恩诺沙星内标峰面积测量引入的不确定度分量的确定。为确定恩诺沙星标准溶液峰面积的重复性标准偏差，重复测量标准品浓度和内标质量浓度均为20 ng/mL 的恩诺沙星标准品6 次，得到峰面积见表2。

单次测量恩诺沙星峰面积的相对标准偏差按如下公式计算：

表1 6 个试验样品的恩诺沙星含量

表2 6 次恩诺沙星标准溶液峰面积

取6 次平均值的相对标准偏差为：

按相同公式计算得到内标面积的相对标准偏差：

3）不确定度的合成。

试样中恩诺沙星X 含量的合成不确定度按下式计算：

取包含因子k=2，扩展不确定度：U（X）=ku（X）=2×0.123=0.25 μg/kg

相对扩展不确定度：Urel（X）=0.25÷9.88×100%=2.5%

2 讨 论

目前测量不确定度的评定方法有2 种，A 类方法和B 类方法，A 类方法即测量不确定度的A 类评价，用试验标准偏差或它的倍数来表示，只要某个是可以重复测量的，在评价其不确定度时，首先应当考虑重复测量引入的不确定度。本试验测量6 个平行样本，以此获得重复测量引入的不确定度。B 类方法是B 类评定，是用不同于测量不确定度A 类评定的方法对测量不确定度分量进行的评定[7,11]，是不具有统计规律引入的不确定度分析，即对试验过程中使用的天平、量具等设备引入的不确定度。在本试验中，考虑到了称样使用的天平、定容使用的容量瓶，根据检定证书上的扩展不确定度，计算标准不确定度。按照农业农村部推荐标准中规定的条件测定鸡肉中恩诺沙星残留量，参考中国农科院建立方法《鸡蛋和鸡肉中氟喹诺酮类药物及金刚烷胺残留测定操作细则》，本试验测定6 份样品取平均值报告结果，其结果和扩展不确定度为9.88±0.25 μg/kg，包含因子k=2，相对扩展不确定度为2.5%。

3 结 论

利用液相色谱质谱联用法（LCMS）测定鸡肉中恩诺沙星含量时，评价不确定度应引入多次重复测量、天平称量、标准品配制、定容体积等因素。