枯草芽孢杆菌L07产中性蛋白酶发酵条件优化

卢超，陈景鲜，王国霞，陈刚，李春阁，王会鱼

(郑州师范学院 生命科学学院，河南 郑州，450044)

蛋白酶根据其最适pH可分为酸性、中性和碱性3种，因此，中性蛋白酶是一类能够在pH=6.5～7.5的环境中催化蛋白质发生水解，产生游离氨基酸和多肽片段的酶的总称[1-3]。中性蛋白酶是很早就在工业生产中使用的蛋白酶类，广泛应用于食品、饲料、医药、洗涤、化妆品、纺织等行业[4-7]。中性蛋白酶的广泛使用是由于其作为天然生物酶制剂，具有催化条件温和，催化速率高，无工业污染等特点，与一般的化学添加剂相比，对人和动物更加安全可靠[8]。目前，生产中性蛋白酶的微生物主要包括细菌、霉菌、酵母和放线菌等[9]。

枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是一类需氧型的革兰氏阳性菌，在土壤、海洋、动物、植物中广泛存在[10]。同时，枯草芽孢杆菌具有易于存活、生长繁殖快，无致病性的特点，能够分泌蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、葡聚糖酶、植酸酶、果胶酶等十几种酶[11-15]。因此，枯草芽孢杆菌在改善肠道菌群、调节免疫力、促进植物生长、改善脂类代谢等方面都有广泛应用[16-18]。本实验室前期分离出1株具有高产中性蛋白酶潜力的枯草芽孢杆菌L07，本实验主要对枯草芽孢杆菌L07产中性蛋白酶的能力进行考察，以碳源、氮源、吐温-80、初始pH、MgSO4、种子液添加量、发酵温度、发酵时间为条件进行单因素实验分析，再通过Plackett-Burman实验、最陡爬坡实验和Box-Behnken实验响应面分析，最终确定枯草芽孢杆菌L07产中性蛋白酶的最优发酵条件。

1 材料与方法

1.1 实验材料

枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)L07由本实验室前期筛选并保藏，实验所用试剂为市售分析纯。

种子培养基(g/100mL)：NaCl 1、牛肉膏1、蛋白胨1，pH 7.0，高温高压灭菌后在30 ℃条件下振荡培养到A600=1.0为制备种子液；

基础发酵培养基(g/100mL)：蔗糖5、蛋白胨5、MgSO40.1、吐温-80 0.1 mL/100mL、pH 6.8，高温高压灭菌后加入种子液3 mL/100mL，在30 ℃环境下振荡培养36 h。

1.2 实验方法

1.2.1 中性蛋白酶酶活力的测定

各组发酵结束后，4 ℃离心取上清，即得待测发酵粗酶液。参考GB/T 23527—2009，采用Folin-酚法进行蛋白酶酶活力的测定[19-21]。在pH 7.2、40 ℃的条件下1 mL粗酶液1 min水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸定义为1个活力单位(U)，以U/mL表示,如公式(1)所示:

中性蛋白酶活力(U/mL)=A×N×4/10

(1)

式中：A为由吸光度对应的酪氨酸微克数；4为反应总体积；10为反应时长；N为稀释倍数。

1.2.2 单因素实验分析

1.2.2.1 蔗糖、蛋白胨添加量对菌种产中性蛋白酶的影响

分别在编号1～7的7个新配置基础培养基中加入终质量浓度为8、10、12、14、16、18、20 g/100mL的蔗糖溶液，其余按上述基本培养基的成分和条件进行培养，发酵结束后进行酶活力测定。

分别在编号1～7的7个新配置基础培养基中加入终质量浓度为6、9、12、15、18、21、24 g/100mL的蛋白胨，其余按上述基本培养基的成分和条件进行培养，发酵结束后进行酶活力测定。

1.2.2.2 吐温-80、初始pH对菌种产中性蛋白酶的影响

分别在编号1～7的7个新配置基础培养基中加入终浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL/100mL的吐温-80，其余按上述基本培养基的成分和条件进行培养，发酵结束后进行酶活力测定。

分别将编号1～7的7个新配置基础培养基调整初始pH至6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8，其余按上述基本培养基的成分和条件进行培养，发酵结束后进行酶活力测定。

1.2.2.3 MgSO4、种子液添加量对菌种产中性蛋白酶的影响

分别在编号1～7的7个新配置基础培养基中加入终质量浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 g/100mL的MgSO4，其余按上述基本培养基的成分和条件进行培养，发酵结束后进行酶活力测定。

分别在编号1～7的7个新配置基础培养基中加入终浓度为3、5、7、9、11、13、15 mL/100mL的种子培养液，其余按上述基本培养基的成分和条件进行培养，发酵结束后进行酶活力测定。

1.2.2.4 发酵温度、发酵时间对菌种产中性蛋白酶的影响

配制编号1～7的7个新配置基础培养基，分别置于30、32、34、36、38、40、42 ℃条件下进行培养，其余按上述基本培养基的成分和条件进行培养，发酵结束后取培养液进行酶活力测定。

配制编号1～7的7个新配置基础培养基，分别培养40、44、48、52、56、60、64 h，其余按上述基本培养基的成分和条件进行培养，发酵结束后取培养液进行酶活力测定。

1.2.3 Packett-Burman实验分析

根据单因素试验结果，采用Packett-Burman设计法，对蔗糖(A)、蛋白胨(B)、吐温-80(C)、初始pH(D)、MgSO4(E)、接种量(F)、发酵温度(G)、发酵时间(H)这8个影响菌种产中性蛋白酶的实验因素进行探究，从中确定出3个相对较显著的影响因子，以便进行下一步实验。这8个影响因子分别取高低2个水平，以发酵液的中性蛋白酶活力为单一响应值，Packett-Burman实验设计的因子和水平如表1所示。

1.2.4 最陡爬坡实验分析

根据上一步Packett-Burman实验结果筛选得出的3个显著因子，参考各个显著因子的正负效应值，确定最陡爬坡实验的适当步长。以最陡爬坡实验结果的最大响应值作为下一步Box-Behnken实验分析的中心点。

1.2.5 Box-Behnken实验分析

根据Packett-Burman实验筛选得出的3个显著因子，最陡爬坡实验得出3个显著因子的质量浓度范围，利用Design-Expert 8.0.5软件进行Box-Behnken实验设计和数据分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果与分析

2.1.1 蔗糖、蛋白胨添加量对菌种产中性蛋白酶的影响

碳源在微生物的生长过程中普遍发挥着重要的作用，而氮源添加量则对微生物合成蛋白质和产酶有重要影响。本实验选择蔗糖作为碳源、蛋白胨作为氮源，两者添加量对菌种产中性蛋白酶的影响如图1所示。由图1可知，当蔗糖的添加量从8 g/100mL上升到16 g/100mL时，枯草芽孢杆菌L07产酶活力呈现缓慢上升的趋势，而在培养基中蔗糖含量在16～20 g/100mL阶段时，出现了相对明显的下降。当蛋白胨的添加量从6 g/100mL上升到15 g/100mL时，枯草芽孢杆菌L07产酶活力呈现明显上升的趋势，而在培养基中蔗糖含量在15～24 g/100mL阶段时，出现了明显的下降。

图1 蔗糖和蛋白胨添加量对产酶的影响

2.1.2 吐温-80、初始pH对菌种产中性蛋白酶的影响

吐温-80作为微生物发酵常见的表面活性剂，可能在调节细胞膜的通透性上有积极的作用。吐温-80、初始pH对菌种产中性蛋白酶的影响如图2所示。当吐温-80的添加量从0.1 mL/100mL上升到0.4 mL/100mL时，枯草芽孢杆菌L07产酶活力呈现缓慢上升的趋势，而随着吐温-80在培养基中含量增高，培养基中酶活力出现了相对明显的下降。而当培养基中的初始pH从6.6调整到7.8的过程中，枯草芽孢杆菌L07产酶活力呈现一个起伏的趋势。

图2 吐温-80和初始pH对产酶的影响

2.1.3 MgSO4、种子液添加量对菌种产中性蛋白酶的影响

无机盐可以调节微生物的生长过程中细胞膜的渗透压，而Mg2+作为许多蛋白酶的辅助因子，对维持酶的催化性有重要作用。由图3可知，当MgSO4的添加量从0.2 g/100mL上升到0.4 g/100mL时，枯草芽孢杆菌L07产酶活力呈现上升的趋势，而在培养基中MgSO4含量继续增加到1.4 g/100mL时，培养基中酶活力出现了相对明显的下降。当培养基中的种子液含量从3 mL/100mL上升到13 mL/100mL时，枯草芽孢杆菌L07产酶活力呈现持续上升的趋势，而在培养基中种子培养液继续增加到15 mL/100mL，酶活力下降。

图3 MgSO4和接种量对产酶的影响

2.1.4 发酵温度、发酵时间对菌种产中性蛋白酶的影响

发酵温度和发酵时间能够影响微生物的动态生长过程和代谢过程。由图4可知，当发酵温度从30 ℃上升到38 ℃的时候，枯草芽孢杆菌L07产酶活力呈现缓慢上升的趋势，发酵温度继续升到42 ℃的时候，酶活力出现了相对较快下降。当发酵时间从40 h持续增加到60 h期间，枯草芽孢杆菌L07产酶活力呈现持续上升的趋势，继续发酵到64 h时，发酵

图4 发酵温度和发酵时间对产酶的影响

液中酶活力下降。

2.2 Packett-Burman实验结果

根据单因素试验结果，利用Minitab 17软件进行Packett-Burman实验设计。Packett-Burman实验设计和实验结果如表1所示，Packett-Burman实验结果分析如表2所示。

表1 Plackett-Burman实验设计和结果

对表1所列的Packett-Burman实验结果进行方差分析得到回归模型方程：Y=160.11-4.58A+21.07B+1.73C+6.47D-19.29E+36.40F+6.86G+15.54H。该模型R2=0.985 3，说明模型显著，拟合良好。根据表2所列的方差分析结果可知，8个影响因子的显著性排序为F(接种量)>B(蛋白胨)>E(MgSO4)>H(发酵时间)>G(发酵温度)>D(初始pH)>A(蔗糖)>C(吐温-80)，且F(接种量)、B(蛋白胨)、E(MgSO4)3个因子的添加量在8个因子中最显著。因此确定接种量、蛋白胨、MgSO4这3个因子进行下一步的最陡爬坡实验。

表2 Plackett-Burman实验结果显著性分析

2.3 最陡爬坡实验分析

根据表1的Packett-Burman实验结果，在最陡爬坡实验中将4个不显著因子维持相对较低水平。对于Packett-Burman实验筛选得出的接种量、蛋白胨和MgSO43个最显著因子，参考这3个因子的效应值可知，接种量和蛋白胨含量对产酶的影响为正效应，MgSO4含量对产酶的影响为负效应。因此在最陡爬坡实验中需要逐步升高接种量和蛋白胨含量，降低MgSO4的含量。

最陡爬坡实验结果如表3所示，随着接种量、蛋白胨和MgSO4三个因子在发酵液中含量的变化，枯草芽孢杆菌L07产酶呈现先上升后下降的趋势。最陡爬坡实验中最优实验结果为第4组，即接种量为13 mL/100mL、蛋白胨质量浓度为15 g/100mL，MgSO4质量浓度为0.4 g/100mL，以此质量浓度为中心点进行下一步Box-Behnken实验分析。

表3 最陡爬坡实验设计和结果

2.4 Box-Behnken实验分析

根据前面Packett-Burman实验筛选得出的3个显著因子，最陡爬坡实验得出3个显著因子的浓度范围，利用Design-Expert 8.0.5软件进行Box-Behnken实验设计和数据分析，结果如表4、5所示。

表4 Box-Behnken实验设计和结果

表5 回归模型的方差分析结果

通过Design-Expert 8.0.5软件得到接种量、蛋白胨和MgSO4含量3个因子之间的模型响应曲面图如图5所示。由图5可知，当蛋白胨含量一定时，随着种子液含量升高，发酵液中性蛋白酶活力呈现先增高后降低的趋势，这可能是由于随着菌体的生长繁殖，培养基中的营养成分消耗在加速，同时溶氧供应不足从而影响了中性蛋白酶的合成。此外，大量菌体分泌代谢产物的迅速增多可能会导致反馈抑制。当接种量一定时，适当的Mg2+能够增加菌体细胞膜的通透性和渗透压，有利于中性蛋白酶的合成和释放，而当无机盐离子质量浓度过高时，可能会影响菌体的正常生长代谢。同时，蛋白胨为枯草芽孢杆菌L07的产酶提供了重要的氮源，而当蛋白胨在发酵液中超过一定质量浓度的时候，可能会影响发酵液的通透性和溶氧量，从而影响菌种的产酶。综上所述，根据建立的数学模型分析，3个影响因子在A=0.19、B=0.15、C=-0.065时，有最佳产酶响应值。换算为接种量在13.4 mL/100mL、蛋白胨含量在15.3 g/100mL、MgSO4含量在0.39 g/100mL条件下，此时枯草芽孢杆菌L07产中性蛋白酶活力值预测将达到401.005 U/mL。

a-接种量和蛋白胨对中性蛋白酶活力的影响；b-接种量和MgSO4对中性蛋白酶活力的影响；c-蛋白胨和MgSO4对中性蛋白酶活力的影响图5 各因素对产酶影响的响应曲面图

为了验证该模型的准确性和实用性，按照上述的预测发酵条件进行3次平行实验验证，结果测得枯草芽孢杆菌L07产中性蛋白酶活力分别为402.13、401.25、401.83 U/mL。3次平行实验验证的平均值为401.74 U/mL，与理论预测值401.005 U/mL非常贴近，说明该模型有良好的准确性和实用性。

3 结论

本文通过单因素实验、Plackett-Burman实验、最陡爬坡实验和响应面Box-Behnken实验设计对枯草芽孢杆菌L07产中性蛋白酶的发酵条件进行优化。得到最佳发酵条件为蔗糖10 g/100mL、蛋白胨15.3 g/100mL、吐温-80为0.2 mL/100mL、初始pH 6.8、MgSO40.39 g/100mL、接种量13.4 mL/100mL、发酵温度32 ℃、发酵时间44 h，在此发酵条件下理论预测枯草芽孢杆菌L07产中性蛋白酶酶活力为401.005 U/mL，实测值达到401.83 U/mL，比最初优化前133.42 U/mL提高了2.01倍。