苗药课币有水溶性黄酮的纯化*

赵学芬，何席呈，2，杜汪洋，谭 波，张 婷，吴珊珊，杜 江，2▲

(1贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025；2贵州省苗医药重点实验室，贵州 贵阳 550025；3贵州中医药大学第二附属医院，贵州 贵阳 550025)

苗药课币有(kod bit vud)来源于天南星科植物一把伞南星Arisaemaerubescens(Wall.) Schott的块茎[1]。多生于海拔3200米以下的林下、灌丛及阴湿的沟谷里；其植物除西北、西藏外，大部分省都有分布[2]。苗医认为课币有(kod bit vud)味麻、辣，性热；有毒，入冷经，走中、里两关，入脑、身两架；具有败毒，清风毒，止痉，化痰散结的功能[3]。现代研究发现，Arisaemaerubescens(Wall.) Schott(A.erubescens)的化学成分有：黄酮类[4]、脂肪酸[5]、生物碱[6-8]、挥发性成分[9]等；具有抗肿瘤[12]、抗氧化[13]、抗惊厥[14]、镇痛[15]等药理作用。为研究挖掘苗药课币有的使用价值，本文研究利用聚酰胺树脂的氢键吸附作用，纯化课币有(kod bit vud)中水溶性黄酮的最优工艺条件。

1 实验器材

1.1 仪器

MS105DU分析天平(梅特勒)、DK-98-Ⅱ数显恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)、L530R离心机(长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司)、UV-1800紫外分光光度仪(岛津)等。

1.2 试药

实验中用的药材饮片，采购于贵阳太升药材市场，经贵州中医药大学鉴定教研室刘晓龙老师鉴定为天南星科一把伞南星Arisaemaerubescens(Wall.) Schott.的块茎；芹菜素对照品(厂家：贵州迪大生物科技有限责任公司，CAS NO：520-36-5)；实验过程中使用的水均为蒸馏水，无水乙醇、三乙胺均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 水溶性黄酮含量的测定

参照2015年版《中国药典》一部天南星项下含量测定方法测定[15]。

2.1.1 对照品溶液的制备

精密称取芹菜素对照品12.06 mg，置100 mL量瓶中，加0.1%三乙胺的60%乙醇溶液使溶解，并定容至刻度，摇匀，精密量取该溶液1 mL，于10 mL量瓶中，加0.1%三乙胺的60%乙醇溶液至刻度，摇匀，即得浓度为12.06 μg·mL-1的溶液。

2.1.2 标准曲线的绘制

精密量取对照品溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL，分别置10 mL量瓶中，各加60%乙醇溶液至5 mL，加1%三乙胺溶液至刻度，摇匀，以相应试剂为空白，按照紫外-可见分光光度法(通则0401)，在400 nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，芹菜素浓度为横坐标，绘制标准曲线，其线性回归方程为：y=0.059x+0.0056，相关系数r=0.9999，线性范围为2.412～12.06 μg·mL-1。

2.2 水溶性黄酮纯化工艺优选

2.2.1 水溶性黄酮溶液的制备

取药材粉末(过二号筛)12.0 g，精密称定，加水240 mL，摇匀，在45 ℃的恒温水浴锅中加热90 min，时时振摇；取出，放冷至室温，离心(4000 r·min-1，10 min)，取上清液；残渣再加水240 mL，在同样条件下再提取一次；合并两次上清液，加水至600 mL，摇匀，即得。

2.2.2 聚酰胺树脂预处理

将聚酰胺树脂用湿法装柱后，先用95%乙醇冲洗至流出液置蒸发皿中蒸干无残渣，再分别用80%乙醇溶液、60%乙醇溶液、40%乙醇溶液、20%乙醇溶液各3个柱体积冲洗，最后用蒸馏水冲洗，至流出液无醇味，即可。

2.2.3 聚酰胺树脂的动态吸附考察

取5 mL已处理的聚酰胺树脂，以1 mL·min-1的流速加入水溶性黄酮溶液，溶液共计200 mL，收集流出液，每一个柱体积收集一份。将收集的流出液离心(4000 r·min-1，10 min)，精密量取上清液2 mL，照2.1.2项下自“置10 mL量瓶中，加水至5 mL……”依法测定。以柱体积为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制聚酰胺树脂动态泄漏曲线，见图1。结果表明，上样水溶性黄酮溶液5个柱体积，聚酰胺树脂出现明显的泄漏。

图1 聚酰胺动态泄漏曲线Fig.1 Dynamic leakage curve of polyamide

2.2.4 聚酰胺柱流速考察

分别取5 mL已处理的聚酰胺树脂于直径为1.5 cm的层析柱中，分别以流速：1 mL·min-1、2 mL·min-1、3 mL·min-1、4 mL·min-1加入水溶性黄酮溶液溶液各70 mL，收集流出液，照2.2.3项下的方法进行测定。绘制不同流速聚酰胺树脂的泄漏曲线，见图2。结果显示，在直径为1.5 cm的层析柱中，以1 mL·min-1的流速上样，聚酰胺树脂泄漏缓慢，即以流速/直径比为0.67时上样，动态吸附能力最优。

图2 不同流速聚酰胺泄漏曲线Fig.2 Polyamide leakage curves of different flow rates

2.2.5 洗脱溶剂考察

依次以20%、40%、60%、80%、95%乙醇浓度，以流速1 mL·min-1洗脱上样的聚酰胺柱各3个柱体积，收集不同浓度下洗脱液，分别以相应溶剂定容至25 mL，摇匀；照2.2.3项下的方法进行测定绘制洗脱曲线。见图3。结果显示，以乙醇浓度为60%的溶液洗脱，黄酮的累积洗脱量最高，故选择60%乙醇溶液洗脱剂。

图3 洗脱溶剂考察Fig.3 Investigation on the elution solvent

2.3 二次上样的理论计算

根据图1可知，连续上样原液5个柱体积以后，聚酰胺层析柱吸附速率出现明显下降，泄漏量增多，但层析柱还保有较多的吸附能力，本实验尝试对此进行优化。根据动态泄漏曲线的结果，在上样的每一时刻，将流出液重新加入层析柱中，由于流出液中目标物质浓度较低，使得该浓度下单位柱体积目标物的量低于此时的吸附速率，那么理论上就不会有发生泄漏，从而流出液不必再做回收处理。如表1表2所示，上样原液9个柱体积原液时，可最大限度利用树脂的吸附能力；当上样原液10个柱体积时，采用二次上样方法，聚酰胺树脂理论上开始泄漏。

表1 一次上样动态泄漏Tab.1 Dynamic leakage of the first sample loading

表2 二次上样理论泄漏量Tab.2 Theoretical leakage of the second sample loading

2.4 验证实验

2.4.1 样品溶液的制备及含量测定

精密称取药材粉末(过二号筛)20.0123 g，加水400 mL，混匀，置于45 ℃的恒温水浴锅中加热90 min，时时振摇；取出，放冷至室温，离心10 min(4000 r·min-1)，取上清液，另存；残渣加水400 mL，在同一条件下重复提取一次；合并两次上清液，加水至1000 mL，摇匀，即得。精密量取其溶液2 mL，依法测定吸光度。结果以芹菜素计，溶液中黄酮含量为23.84 mg。样品总膏重为4.4560 g，样品含量为0.54%。

2.4.2 聚酰胺树脂的纯化

取110 mL聚酰胺树脂于直径为5.5 cm的层析柱中，用5倍柱体积蒸馏水冲洗，以3.7 mL·min-1的流速(流速/直径为0.67)，加入样品溶液共计950 mL(约9倍柱体积)，收集流出液，混合均匀，重新上样到层析柱中；收集流出液，混合均匀，精密量取2 mL，依法测定吸光度为0.0810，说明流出液无目标物。

以60%乙醇溶液作洗脱溶剂，以一个柱体积为单位收集洗脱液，分别精密量取洗脱液2 mL，依法测定绘制曲线，见图4。结果表明5个柱体积洗脱效果较好。

图4 洗脱溶剂体积考察Fig.4 Investigation on the volume of the elution solvent

纯化后的样品总量为48.0 mg；以相同方法测定吸光度，以芹菜素计，黄酮含量为18.86%，纯度提高了34倍。

3 讨论

运用聚酰胺树脂纯化苗药课币有中水溶性黄酮，最优条件为：采用二次上样的方法，原液上样9个柱体积，流速/直径比为0.67，以60%乙醇溶液作洗脱剂，洗脱5个柱体积。经放大22倍验证，二次上样后几乎无目标物泄漏，水溶性黄酮含量比纯化前提高了34倍。

运用二次上样的方法，能最大程度上利用树脂和样品，减少对流出液的后续处理步骤，极大提高了纯化效率。本实验通过聚酰胺对课币有中水溶性黄酮进行富集与纯化，为下一步更深入的研究奠定了基础。