多抗霉素B组分的高效液相与质谱联用的检测方法

张楠高波潘忠成张心心郭秀艳翁婧李蒲民

(1.陕西麦可罗生物科技有限公司，陕西 渭南715500；2.哈尔滨工程大学材料科学与化学工程学院教育部超轻材料教育部重点实验室，黑龙江 哈尔滨150001)

前言

多抗霉素又叫多氧霉素，在日本是从可可链霉菌素阿索变种(S.ca ca oi var.asoensis)中分离到一种核苷类抗生素[3,8]，而在我国是金色产色链霉菌(S.aurea chromogemes,4896)的次级代谢产物。多抗霉素属于广谱性生物杀菌剂，具有较好的内吸性传导作用。其作用机理是抑制菌体细胞壁几丁质的生物合成，使菌体细胞壁不能进行生物合成而导致死亡，还能抑制病菌产孢和病斑扩大[3,6]。多抗霉素主要用于苹果斑点落叶病、梨黑星病、葡萄灰霉病、黄瓜霜霉病、番茄晚疫病、人参黑斑病等多种植物病害的防治[1-7]。有关金色产色链霉菌产多抗霉素的合成机理、多抗霉素合成基因簇、多抗霉素核苷骨架、金色产色链霉菌与其它链霉菌基因杂合产的次级代谢产物的研究，国内外已有大量报道[7-13]，但目前对多抗霉素B的分析方法主要是生物效价测定法，该方法操作复杂，耗时长、准确度低、精密度差，而且多抗霉素产品为多组分，生测法无法确认是多抗霉素哪种组分，只能测出其生物活性，不适合用于生产企业的质量控制和市场监督检测。本文经过多次试验，摸索出多抗霉素B的高效液相色谱法与质谱联用的检测方法。该方法在国内还未见报道，具有操作简单快速、定量分析准确的优点，易于推广。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

金色产色链霉菌(S.aurea chromogemes,4896)由陕西麦可罗生物科技有限公司菌种中心保藏。

1.1.2 发酵设备与条件

三级发酵设备购置于南京天汇生物科技有限公司，零级发酵罐总体积为5L，一级发酵发酵罐体积为30L，三级发酵罐体积为50L。每个发酵罐安装消毒的空气导管，消毒空气由小型空气压缩机产生并由导管输入至发酵罐(装有空气流量计)，消毒罐体的水蒸气由蒸汽发生器产生并由导管输入至发酵罐(中间装有电磁阀、蒸汽计量计)，每个发酵罐装有实时监控溶解氧、pH、温度、转速、补料、消泡和补酸碱系统。各级发酵罐的发酵培养基：玉米粉为0.3%，葡萄糖为0.35%，酵母浸粉为0.35%，KH2PO4为0.15%，CaCO3为0.45%，豆粕0.45%，鱼粉0.13%，NaCl为0.15%，豆油0.015%，(NH4)2SO4为0.1%，GPE消泡剂0.006%，淀粉酶0.0005%，余量为灭菌水。批次接种量为发酵体积的10%～15%，零级发酵时间为30h，一级发酵时间24h，二级发酵时间为110h。二级罐发酵110h后的发酵液经12000rmp超速离心30min的上清液依次经陶瓷膜过滤(膜平均孔径0.1μm，跨膜压0.2～0.3mPa),过滤液再次经纳滤膜过滤(截留分子量500以上的纳滤膜)，截留液经喷雾干燥塔制得多抗霉素粗粉。

1.1.3 实验仪器与试剂

高效液相色谱仪：waters高效液相色谱仪；质谱仪：Bruker 500MHz；玻璃器皿：50mL容量瓶；分析天平：梅特勒—托利多。

多抗霉素B标准品：自制，纯度99.99%，将多抗霉素喷雾干燥的粗粉经活性碳脱色、去蛋白、离子交换树脂去离子后经液相制备柱获得多抗B纯品；甲醇：色谱纯；水：超纯级；甲酸：分析纯。

1.2 测试方法

1.2.1 液相色谱与质谱试验条件

液相色谱柱：4.6mm×250mm，内装C18填料；流动相：(配置1‰甲酸水溶液)，V水+V甲醇=95%+5%；柱温：35℃，进样体积：10μL；流速：1.0mL·min-1；检测波长：260nm，停留时间8.5min。质谱测试：将10mg的多抗霉素标准品(样品)N置于5mm核磁管中，加入0.50mL的D2O至管中，混合均匀后在Bruker500MHz设定好的条件下进行测试。

1.2.2 多抗霉素标准品溶液的配置

分别称取多抗霉素B标准品约50mg至同一50mL容量瓶中，用水稀释定容，然后分别用移液管取1mL至同一5mL容量瓶中，用水稀释定容。

1.2.3 样品溶液的配置

称取含多抗霉素的样品100mg至10mL容量瓶中，用水溶解并定容，用0.45μm滤膜过滤，备用。

1.2.4 定量分析

仪器达到平衡稳定后，以下列序列的形式进行标准品溶液、两针样品溶液、标准品溶液的定量分析，最终获取多抗霉素BCN吸收峰的面积。

1.2.5 计算

多抗霉素原药中多抗霉素B的质量分数ω1(%)按式(1)计算：

(1)

式中，ω1为试样中多抗霉素B质量分数，以%表示；A2为试样多抗霉素B峰面积；m1为标样的质量，g；ω为标样中多抗霉素B质量分数，以%表示；A1为试样多抗霉素B峰面积；m2为试样的质量，g；N为稀释因子，n=25。

2 结果与讨论

2.1 多抗霉素B标准品的质谱测试结果

称取10mg的多抗霉素B标准品(样品)置于5mm核磁管中，然后加入0.50mL的D2O至管中，混合均匀后在Bruker 500MHz设定好的条件下进行测试。具体测试结果如图1。

从图1可知，标准品中有效成分质荷比为508，多抗霉素B的分子式为C17H25N5O13，CAS19396-06-6；多抗霉素B分子量为507，从而可以确认制备所得样品为多抗B样品。

图1 多抗霉素B标准品的质谱测试结果

2.2 有效成分分析的系统一致性

准确称取标准品B 699.6mg(编号A1)，至50mL容量瓶中，用超纯水稀释定容。然后单独进样。

用移液管移取A1标准溶液各1mL于5mL容量瓶中，再用移液管移取2mL纯水混合均匀，待用；A1稀释3倍后连续6次进样测试，具体测试结果见表1。

从表1可知，多抗霉素B保留时间相对标准偏差为0.79，峰面积相对标准偏差为0.94；证明系统一致性好。

2.3 线性响应的测定

浓度1样品：用移液管分别移取A1标准溶液各1mL于5mL容量瓶中，再加2mL纯水，混合均匀，待用。将A1稀释3倍的样品标号AD1；用移液管分别移取A1标准溶液各1mL于5mL容量瓶中，混合均匀，用纯水定容，待用，将A1稀释5倍的样品标号为AD2；用移液管分别移取A1标准溶液1mL于10mL容量瓶中，混合均匀，用纯水定容，将A1稀释10倍的样品标号为AD3；用移液管分别移取A1标准溶液1mL于25mL容量瓶中，混合均匀，将A1稀释25倍的样品标号为AD4；用移液管分别移取A1标准溶液各1mL于50mL容量瓶中，混合均匀，将A1稀释50倍的样品标号AD5。具体测试结果见表2和图2。

表2 不同稀释浓度的多抗霉素B高效液相测试结果

图2 不同浓度的多抗霉素B与高效液相测试峰面积关系

从表2和图2可知，多抗霉素B浓度与高效液相色谱测试的峰面积有很好的相关关系，其相关系数R2=0.9997。

2.4 精密度的测试结果

分别选择有代表性的陕西麦可罗生物科技有限公司生产的3%多抗霉素可湿性粉剂和兴农16%多抗霉素可溶粒剂，同一样品，重复测定几次，按1.2的操作条件进行测定，具体测定结果见表3。

从表3可知，陕西麦可罗3%多抗霉素可湿性粉剂中的多抗霉素B的变异系数为0.63%，兴农16%多抗霉素可溶性粒剂的多抗B的变异系数1.03，进一步说明2种市场产品的多抗B的测定具有良好的精密度。由多抗霉素B高效液相测试图3可知，两者样品的多抗B出峰时间为8.5min，在相同称量值，两者峰面积差别不大，进一步说明陕西麦可罗3%多抗霉素可湿性粉剂与兴农16%的多抗霉素可溶性粒剂各自多抗B的含量占比差别不大。

表3 不同来源样品的多抗霉素B高效液相测试结果

图3 多抗霉素B的高效液相色谱图

3 结论

试验建立了高效液相色谱法检测多抗霉素制剂样品有效成分的分析方法。试验结果表明，此高效液相色谱法在测试范围内线性关系良好，方法精密度准确性良好，具有操作简便、快速的特点，是产品质量控制和应用研究中较为理想的分析方法。